郑州大学李朝晖、孙远强 ACS:基于分子内弯曲机制限制,合理设计用于 Gossypol 感测的“导通”超分子荧光探针

原文链接：10.1021/acs.analchem.5c07853

在食品安全检测领域，快速、精准识别无反应活性位点的有毒污染物，一直是困扰科研人员的难题。棉酚作为棉花籽制品中常见的有毒酚类化合物，具有生殖毒性、心脏毒性等危害，严重威胁人体健康，其高效检测对保障食品安全至关重要。

近日，郑州大学李朝晖、孙元强团队新提出限制分子内弯曲（RIB）机制，设计出基于 BODIPY 的荧光分子 IPR，其与人体血清白蛋白（HSA）形成IPR@HSA 超分子探针，通过 HSA 疏水空腔限制 IPR 弯曲振动激活荧光；以有毒污染物棉酚为模型分析物，棉酚结合 HSA 引发变构效应，进一步强化 IPR 限制实现信号二次放大，该探针响应时间不足 10 秒，检测精度达微摩尔级别，为食品安全监控提供了全新工具。相关研究成果发表于《ACS Analytical Chemistry》上。

核心结论

l选取光稳定性优异、量子产率高的 BODIPY 为荧光团骨架，通过在中位引入空间位阻较大的异丙基，邻位引入甲基，构建出 IPR 荧光分子。这些 bulky 取代基会增强分子的低频弯曲振动，通过振动耦合促进非辐射衰减，使 IPR 在溶液中荧光几乎完全淬灭，处于 “暗态”，为后续 “点亮” 响应奠定基础。

l将 IPR 与人体血清白蛋白（HSA）结合，形成 IPR@HSA 超分子探针：HSA 的疏水空腔会对 IPR 形成物理限制，有效抑制其分子内弯曲振动，阻断非辐射衰减通道，使 IPR 荧光“点亮”，实现从“暗态”到“亮态”的转变。分子动力学模拟与 ONIOM 模型计算证实，IPR 与 HSA 以 2:1 比例结合，主要通过范德华力相互作用，HSA 空腔的空间 confinement 是荧光激活的关键。

l棉酚与 HSA 的 IB 位点特异性结合后，会引发 HSA 构象变化（变构效应），进一步收紧疏水空腔，加剧对 IPR 分子振动的限制，导致荧光强度二次增强。这种“组装激活 + 变构放大”的双重机制，让探针对棉酚的检测兼具高灵敏度与高特异性。

佐证方法

l计算模拟：借助 Gaussian 16、GAMESS 等软件，通过量子化学计算明确非辐射跃迁路径，结合分子对接、100 ns 动力学模拟及 IGMH 分析，验证 RIB 机制与 IPR-HSA 结合模式及稳定性。

l结构表征： Bruker 核磁共振仪获取¹H/¹³C NMR 谱图验证 IPR 结构，通过 XPS 分析电子转移路径，结合 Job’s plot 确定 IPR 与 HSA 2:1 的结合比例，完成探针与复合物结构确认。

l性能测试：通过 UV-vis、荧光光谱等验证探针光学性能与“turn-on”响应，开展 pH、光稳定性及抗干扰测试，结合粘度响应与时间分辨荧光测试，佐证 RIB 机制与检测能力。

l实际样品验证：对猪肉样品经匀浆、提取、浓缩等前处理后，采用 HPLC 辅助加标回收实验，在 0.5-4 μM 浓度下，回收率 80.72%-119.49%，验证实际应用准确性。

图文说明

方案 1. 基于 RIB 策略的 IPR@HSA 超分子荧光探针用于棉酚检测的示意图。

图 1. IPR 的结构与电子性质(a) 用于片段间电荷转移（IFCT）分析的 IPR 化学结构及片段标注：片段 1（绿色）、片段 2（红色）、片段 3（黑色）和片段 4（蓝色）；(b, c) 优化后的（b）基态（S₀）和（c）第一激发态（S₁）分子几何结构；(d) 前线分子轨道与能级图；(e) 空穴 - 电子分析图，展示电子激发过程中电子（绿色）和空穴（蓝色）的分布；(f) 电荷转移矩阵热图，量化由 IFCT 分析得到的分子片段间的分子内电荷转移；(g-l) IPR-L 与 IPR 的光学性质计算结果：(g, j) 通过生成弗兰克 - 康登（FC）点与锥形交叉点（CI）之间的弹性带（NEB）插值路径得到的（g）IPR-L 和（j）IPR 的能量曲线，每个点均进行能量计算；(h, k) 分别为（h）IPR-L 和（k）IPR 在不同振动频率下的黄 - 里斯因子（Huang-Rhys factor）；(i, l) 分别为（i）IPR-L 和（l）IPR 的重组能（λ）随振动频率的分布曲线；（l）中的插图为简正模式向量，指示电子态与振动态之间的主要耦合路径。

图 2.(a) 4 μM IPR 在有机溶剂和水相溶剂中的吸收 - 发射光谱。(b) 4 μM IPR 在甘油 / 磷酸盐缓冲液（Gly/PBS）中的荧光光谱。(c) 激发波长 λₑₓ=460 nm 时，IPR 在 532 nm 处的荧光强度随甘油体积分数的变化曲线。(d) 有无人体血清白蛋白（HSA）存在时，IPR 的吸收光谱与发射光谱。(e) 磷酸盐缓冲液（PBS）中，4 μM IPR 的归一化荧光光谱；(f) HSA 浓度（0-3 μM）与 4 μM IPR 归一化发射强度的线性关系图。(g) 4 μM IPR 对 1.0 mg/mL HSA 的时间依赖性光谱。(h) 在 pH 2-12 的布里顿 - 罗宾逊缓冲液（B-R 缓冲液）中，4 μM IPR 与 3.0 μM HSA 体系的归一化发射强度。(i) 激发波长 λₑₓ=460 nm 时，IPR 对 HSA 相对于干扰物质的选择性。

图 3. IPR@HSA 超分子复合物的结合位点表征(a) 分子对接结构图，显示 IPR 结合于 IIA 口袋内；(b) ONIOM（M06-2X-D3/6-31g (d)：PM6-D3）优化后的簇模型细节图，该模型包含 IPR 周围半径 6 Å 范围内的原子（原文 "ONIOM (M062X-D3/6-31g (d):PM6D3)" 补全规范格式为 "ONIOM（M06-2X-D3/6-31g (d)：PM6-D3）"）；(c) 基于 Hirshfeld 划分的独立梯度模型（IGMH）分析可视化 IPR@HSA 簇模型的弱相互作用，其中波函数在 M06-2X-D3/6-31g (d) 水平下获得；(d, e) IPR@HSA 簇模型的振动耦合计算结果，分别为黄 - 里斯因子（Huang-Rhys factor）和重组能（λ）随振动频率的分布曲线。

图 4.(a) 加入不同浓度棉酚后，IPR@HSA 复合物的发射光谱；(b) 532 nm 处荧光强度与所加棉酚浓度的线性关系图；(c) 激发波长 λₑₓ=460 nm 时，IPR@HSA 用于棉酚检测的选择性与抗干扰性评估；(d) 基于 Hirshfeld 划分的独立梯度模型（IGMH）分析，可视化棉酚结合型 IPR@HSA 簇模型的弱相互作用，其中波函数在 M06-2X-D3/6-31g (d) 水平下获得；(e, f) 棉酚结合型 IPR@HSA簇模型的振动耦合计算结果，分别为黄 - 里斯因子（Huang-Rhys factor）和重组能（λ）随振动频率的分布曲线。

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