郑州大学赵昌成教授等:基于STC-1细胞味觉感知模型的西瓜豆酱鲜味肽的呈味特性分析

西瓜豆酱又名酱豆,是流行于河南、安徽、山东等地区的一种极具地方特色的传统发酵豆制品,具有气味醇香、柔软鲜美、后味绵长等特点^[1]。在发酵过程中,西瓜豆酱中的大豆蛋白经微生物作用分解为多种鲜味氨基酸以及鲜味肽,这一过程使得西瓜豆酱成为研究鲜味肽的理想材料^[2]。本研究团队前期已经从西瓜豆酱中分离纯化出3种鲜味肽——AKEKFD、LAELK和LTFVER,并通过其与T1R1/T1R3鲜味受体的模拟分子对接实验,证实了它们具有潜在呈鲜能力。其中,AKEKFD表现出最低的分子对接能,其次是LAELK和LTFVER。有研究表明,分子对接能越低证明肽段与受体之间结合越紧密,且鲜味肽与受体之间的结合力主要包括范德华力、氢键、疏水作用及静电作用等^[3-5]。本研究涉及的3种鲜味肽与受体之间的主要结合力也符合上述类型。然而,分子模拟对接终究是一种理论预测手段,尚不能完全等同于鲜味肽在真实生物体系中的呈味效果。因此,有必要在细胞水平上对这3种肽段的呈味特性进行实验验证。

为了在细胞水平上验证鲜味肽的活性,选择一个合适的实验体系至关重要。胃肠道内的化学感受细胞,如肠内分泌细胞,与口腔味觉细胞相似,也表达多种味觉受体和信号传导元件,是研究营养物质化学感知的重要平台。其中,小鼠小肠内分泌细胞STC-1已被广泛证实为一个可靠、可重复的肠内分泌细胞模型,可以表达多种鲜味受体与传导元件,包括Ca SR、GPRC6a、T1R1/T1R3、mGluR1、mGluR4、Gα-gustducin、PLC-β2和TRPM5等^[6-7]。其信号传导机制与舌上皮味觉细胞极其相似,均涉及味觉感受细胞内钙储存库中Ca²⁺的释放,且该信号能够通过钙离子荧光响应被有效检测^[8]。此外,研究表明大多数L-氨基酸受体都在STC-1细胞中表达^[7-9],能够激活鲜味受体T1R1/T1R3^[10]。因此,研究通过监测不同浓度鲜味肽作用下STC-1细胞内钙离子荧光信号响应强度的动态变化,评估其对细胞的激活效果;同时,采用qPCR技术测定T1R1/T1R3受体mRNA的表达水平,从而从功能与表达两个层面,综合判断鲜味肽对该受体的激活作用。

目前,鲜味肽的研究多集中于水产品(鱼露、凤尾鱼酱等)和动物源性(骨汤等)产物,而对植物发酵来源(尤其是西瓜豆酱)鲜味肽的机制研究相对较少。不同来源的鲜味肽因结构差异(γ-谷氨酰肽与线性肽等)可能通过不同途径激活T1R1/T1R3受体,进而影响呈味特性^[10-11]。本研究团队前期通过分子模拟对接实验已揭示,西瓜豆酱来源的鲜味肽(AKEKFD、LAELK和LTFVER)在分子结构上与动物源性肽存在显著差异。例如,LAELK肽段中的碱性氨基酸(Lys6)能够与T1R3受体的酸性残基Glu301形成稳定的盐桥,这一特性在动物源性肽(如骨汤肽APKPK)中较为罕见^[3,5]。此外,AKEKFD肽段中的双酸性氨基酸(Glu3和Asp5)可同时与T1R3的Ser385和T1R1的His71形成氢键网络,而动物源性肽主要依赖疏水相互作用(如Phe174)激活受体^[10-11]。这些结构差异导致西瓜豆酱鲜味肽通过不同于动物源性肽的途径激活T1R1/T1R3受体:1)碱性氨基酸介导的静电相互作用增强受体结合稳定性;2)双酸性残基实现协同激活;3)疏水核心(如LTFVER中的Phe4-Val5)调控受体停留时间。

为从细胞水平揭示鲜味肽的呈鲜机制,本研究通过STC-1细胞模型,进一步对西瓜豆酱中鉴定的3种鲜味肽(AKEKFD、LAELK与LTFVER)的呈味特性及其对鲜味受体T1R1/T1R3的激活作用进行系统验证。希望研究能丰富鲜味肽的理论研究体系,为传统发酵豆制品中鲜味肽的挖掘与应用提供新思路,同时为食品工业中天然鲜味剂的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

根据实验室前期的实验结果,即通过感官评价、电子舌分析以及分子对接筛选出综合评分最高的3个鲜味肽的氨基酸序列(AKEKFD、LAELK和LTFVER),委托苏州默迪夫生物科技有限公司进行合成,使用固相肽合成法合成纯度大于95%的肽;小鼠小肠内分泌细胞STC-1,北纳创联生物科技有限公司。

Fluo-8 AM染料,分析纯,上海懋康生物科技有限公司;DMEM-H基础培养基,生化试剂,北纳创联生物科技有限公司;HBSS-Hank’s平衡盐溶液,生化试剂,武汉赛维尔生物科技有限公司;磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L pH=7.2～7.4)、胎牛血清(FBS)(生化试剂)、SYBR Green I 染料(PCR级),北京索莱宝科技有限公司;qPCR试剂盒,生化试剂,南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

Allefra 64型低温高速离心机,上海安亭科学仪器厂;GH-500型恒温培养箱,北京科伟永兴仪器有限公司;D1008型掌上离心机和MX-S型涡旋仪,美国赛洛捷克公司;Observer.Z1型荧光倒置显微镜,德国卡尔蔡司显微镜有限公司;D-8278型实时荧光定量PCR仪,宝日医生物技术(北京)有限公司;HJ-3型恒温磁力搅拌器,苏州国华仪器有限公司;BCD-249型冰箱,河南新飞电器有限公司;YP3002型分析天平,上海佑科仪器仪表有限公司;VANTA star型多功能酶标仪,德国BMG Labtech公司。

1.3 实验方法

1.3.1 STC-1细胞内钙离子荧光信号强度的测定

为探究3种合成肽能否引发STC-1细胞内钙离子荧光信号响应,于加样前后使用荧光倒置显微镜分别采集细胞图像,以对比钙离子荧光信号的变化。显微镜光学参数设定如下:激发滤光片中心波长为(490±20) nm;发射滤光片中心波长为(514±30) nm。

使用0.1 mol/L pH值为7.2～7.4的磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline,PBS)分别配制鲜味肽溶液(样品组)和谷氨酸钠(monosodium glutamate, MSG)溶液(阳性对照组)。阳性对照组选用MSG溶液的终浓度为0.50、1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L,这5种浓度梯度涵盖了常见的食品中MSG的含量范围以及可能的实验研究所需的浓度范围。从较低浓度开始逐渐增加,可以观察到不同浓度下对相关反应或指标的影响,以确定其在实验体系中的作用和效果。而3种鲜味肽(AKEKFD、LAELK以及LTFVER)的终浓度为0.25、0.50、1.0、2.0、4.0 mmol/L,这种梯度则是为了研究不同浓度的鲜味肽在与实验体系相互作用时的表现。较低浓度可以检测到微量的肽对实验结果的影响,而较高浓度则能更明显地观察到肽的作用效果,通过这一系列浓度的设置,可以更全面地了解鲜味肽在特定实验条件下的特性和功能。

以1.0×10⁴/孔的细胞密度将细胞铺于96孔板中,每孔加入90 μL完全培养基(10% FBS+90% DMEM-H培养基)。将96孔板置于37 ℃培养箱中,使细胞贴壁24 h。吸除完全培养基,每孔加入100 μL的4 μmol/L Fluo-8 AM 钙离子荧光探针,完全覆盖细胞,放入37 ℃培养箱中孵育30 min。孵育完成后,吸除钙离子荧光探针,用预温的HBSS-Hank’s平衡盐溶液避光清洗2次以去除多余探针。由于Fluo-8 AM为光敏感探针,后续操作全程避光,避免荧光淬灭影响实验结果^[12]。

将96孔板置于荧光倒置显微镜下,以蓝色荧光作为激发光源,于最佳视角拍摄加样前照片和加样60 s时同一位置的照片(加样后照片)。

1.3.2 STC-1细胞内钙离子实时荧光信号强度的测定

荧光倒置显微镜无法对于荧光进行实时定量,故使用多功能酶标仪对钙离子荧光信号进行实时定量检测,以探究不同浓度样品对于STC-1细胞内钙离子荧光信号响应的实时变化^[13]。多功能酶标仪具备吸光度、荧光及化学发光等多种检测模式。

样品组、阳性对照组浓度,以及细胞在96孔板的铺板操作同1.3.1节;因STC-1细胞属于贴壁细胞,故换用黑框透明底96孔板进行此次实验。将96孔板置于荧光倒置显微镜中,以490 nm作为激发波长,514 nm作为发射波长,对加样前STC-1细胞内钙离子荧光值进行测定。从加样后10 s开始进行钙离子实时荧光值检测,每10 s采集一次数据,持续监测200 s,每组设3个重复孔。根据所记录的实时荧光数据,提取各实验组的钙离子荧光信号峰值作为最大响应值,其所对应的时刻记为最大响应时间,该时刻所对应的鲜味肽浓度即为最大响应浓度。

钙离子实时荧光信号强度用相对荧光值的变化表示^[12],计算见式(1)。

(1)

式(1)中,F为钙离子实时荧光值;F₀为加样前钙离子荧光值。

1.3.3 STC-1细胞鲜味受体T1R1/T1R3的mRNA表达量测定

1.3.3.1 鲜味肽细胞毒性测定

3种鲜味肽的细胞毒性通过Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)实验进行测定,从而验证长时间使用鲜味肽溶液孵育是否会造成细胞活力下降或死亡^[14]。

细胞均液的制备:以每孔1×10⁴细胞密度将细胞铺于96孔板中,于37 ℃贴壁24 h。使用PBS缓冲液制备1.0 mmol/L浓度的3种鲜味肽溶液,样品组每孔加入10 μL鲜味肽溶液,空白对照组(Control组)每孔加入10 μL的PBS缓冲液,37 ℃孵育8 h。

以CCK-8和完全培养基的体积比为1∶10的比例配制CCK-8溶液。样品组和Control组每孔均加入CCK-8溶液110 μL,37 ℃孵育2 h,使用多功能酶标仪于540 nm处测定吸光度值。以细胞活力值(%)表示鲜味肽的细胞毒性。

1.3.3.2 实时荧光定量PCR的测定

根据鲜味肽细胞毒性实验结果,选择合适的孵育时长,使用3种鲜味肽对STC-1细胞进行孵育,提取总RNA并反转录为cDNA。反转录体系(20 μL)包括:4 μL的5×All-in-one qRT SuperMix,1 μL的Enzyme Mix和1 μL的总RNA溶液(500 ng/μL),并用无核酸酶双蒸水补至20 μL。反应程序:第1步,50 ℃条件下反应15 min;第2步,85 ℃条件下反应5 s。

采用SYBR Green嵌合荧光法进行实时荧光定量PCR(qPCR)以检测鲜味肽对受体表达的影响^[15],该方法基于SYBR Green染料与双链DNA 结合后发出荧光的特性,从而实现对PCR扩增过程进行实时监测。实验以鼠源的GAPDH基因作为内参基因,检测3种鲜味肽即AKEKFD、LAELK和LTFVER孵育后STC-1细胞内T1R1和T1R3受体mRNA表达量的变化。qPCR反应总体系为20 μL:包含10 μL 的qPCR SYBR Green,2 μL的cDNA模板,0.4 μL上游引物,0.4 μL下游引物,以及7.2 μL的无核酸酶双蒸水。反应程序如下:95 ℃预变性5 min;随后进行40个循环的扩增(95 ℃变性10 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s)。所用引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

Tab.1 Primer sequences for real-time fluorescence quantitative PCR

鲜味受体T1R1和T1R3的mRNA相对表达量表示为2^-ΔΔC_t。2^-ΔΔC_t 是一种计算实时荧光定量PCR样品中某个基因相对表达量的方法,其中C_t值代表了样品的循环阈值,是指荧光信号达到设定的阈值时所对应的PCR循环次数。在PCR反应过程中,荧光信号会随着扩增循环的进行而逐渐增强。C_t值与起始模板量的对数呈线性关系,即起始模板量越多,达到阈值所需的循环次数越少,C_t值就越小;反之,起始模板量越少,C_t值就越大。通过比较不同样品的C_t值,可以定量分析目的基因在不同样品中的相对表达量。ΔΔC_t的计算公式为ΔΔC_t=ΔC_t(样品)-ΔC_t(空白),其中ΔC_t是用目的基因的C_t值减去内参基因的C_t值得到的差值^[13]。

1.4 数据分析

实验所得数据采用Origin 2021和SPSS 16.0 软件进行绘图、数据处理及分析。荧光倒置显微镜下照片使用ZEN2(Blue Edition)软件进行处理。所有实验和检测均独立重复3次,每次实验设置3个平行样本,以确保数据的可靠性。数值以平均值±标准偏差表示;P<0.05时,表示数值间具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 STC-1细胞内钙离子荧光信号强度检测结果

荧光倒置显微镜是一种用于生物学、医学等领域的重要实验仪器,它结合了倒置显微镜和荧光显微镜的特点,能够在显微镜下观察活体细胞或组织样本的荧光信号^[16]。味觉的产生过程是一个复杂的神经生理学反应,涉及多个步骤和多个感官器官的相互作用,大致流程如下:首先是进食的时候舌头上的味蕾接收到食物的味觉刺激,激活味觉受体与其结合,导致异三聚体G蛋白解离产生βγG蛋白亚基(Gβ3γ13),该亚基向磷脂酶Cβ2(PLCβ2)发出信号,将磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP₂)分解为肌醇1,4,5-三磷酸(IP₃)和二酰基甘油(DAG)。肌醇1,4,5-三磷酸(IP₃)通过与其三型受体(IP₃R₃)结合,打开Ca²⁺通路释放细胞内储存的钙离子,导致细胞内钙离子浓度升高,打开了瞬时电位受体,导致细胞去极化,钠离子内流,并通过钙稳态调节蛋白1(CALHM1)释放ATP到细胞外,随后ATP信号传入味觉神经纤维上的离子型嘌呤受体,触发神经递质的释放,神经递质将味觉信号传递至大脑的味觉中枢,从而产生味觉^[17-18]。由此可以看出,味觉刺激会引起受体细胞中钙离子的瞬时变化,并且受体细胞的激活程度通常与钙离子浓度正相关^[19]。大量研究证实,钙离子浓度的升高是味觉受体细胞被激活后信号级联放大的核心事件和关键第二信使。当T1R1/T1R3味觉受体被配体(鲜味肽或MSG)激活后,通过G蛋白PLCβ₂-IP₃通路触发的钙离子释放。较高的钙离子浓度和持续的钙信号能够增强细胞的去极化程度,促进神经递质和ATP的释放,从而增强味觉信号的强度^[20]。因此,钙信号在味觉信号级联中的枢纽地位,使得钙离子荧光信号响应强度能够作为定量评估味觉受体被激活程度的关键指标。

首先是使用浓度为0.50、1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L的MSG溶液对STC-1细胞进行外部刺激,其对STC-1细胞内钙离子荧光信号强度的变化情况如图1所示。

图中标尺长度为200 μm。

图1 不同浓度MSG溶液加样前后STC-1细胞内钙离子荧光信号强度

Fig.1 Calcium ion fluorescence signal intensity within STC-1 cells before and after MSG addition at different concentrations

由图1可知,不同浓度的MSG溶液均能显著引发STC-1细胞内钙离子荧光信号响应。4.0 mmol/L的MSG溶液在加样后60 s内,荧光信号响应强度增加到峰值,而8.0 mmol/L的MSG溶液荧光信号响应强度略有下降,这表明荧光信号响应强度并不随着溶液浓度的增加而增加,可能与多种因素相关,比如细胞状态、荧光探针进入细胞的程度、每孔内细胞贴壁情况等,并且高浓度MSG溶液可能对细胞产生一定的抑制作用。由于荧光倒置显微镜的荧光值无法定量,故后续选择多功能酶标仪对荧光响应值进行定量。

3种鲜味肽及AKEKFD、LAELK和LTFVER加样前后STC-1细胞内钙离子荧光信号强度测定结果分别如图2、图3和图4所示。3种鲜味肽溶液的浓度均为0.25、0.50、1.0、2.0、4.0 mmol/L。

图中标尺长度为200 μm。

图2 不同浓度鲜味肽AKEKFD加样前后STC-1细胞内钙离子荧光信号强度

Fig.2 Calcium ion fluorescence signal intensity within STC-1 cells before and after umami peptide AKEKFD addition at different concentrations

图中标尺长度为200 μm。

图3 不同浓度鲜味肽LAELK加样前后STC-1细胞内钙离子荧光信号强度

Fig.3 Calcium ion fluorescence signal intensity within STC-1 cells before and after umami peptide LAELK addition at different concentrations

图中标尺长度为200 μm。

图4 不同浓度鲜味肽LTFVER加样前后STC-1细胞内钙离子荧光信号强度

Fig.4 Calcium ion fluorescence signal intensity within STC-1 cells before and after umami peptide LTFVER addition at different concentrations

由图2至图4可知,3种鲜味肽(AKEKFD、LAELK和LTFVER)溶液均可以显著引发STC-1细胞内钙离子荧光信号响应,但60 s可能并非最佳反应时长,后续实验将使用多功能酶标仪对荧光值进行实时定量分析。通过荧光倒置显微镜观察了不同浓度的鲜味肽及MSG溶液对STC-1细胞内钙离子荧光信号响应的影响,结果显示,MSG溶液的荧光信号响应强度随浓度增加呈现先上升后下降的趋势,在4.0 mmol/L浓度下达到最大荧光信号响应值,8.0 mmol/L时荧光信号响应略有下降,表明高浓度MSG可能对细胞产生抑制作用。而LAELK在1.0 mmol/L浓度下即达到最大荧光响应值,表明LAELK在较低浓度下即可产生与MSG相当的激活效果。AKEKFD和LTFVER的最大荧光响应值均略低于MSG溶液,但仍表现出较强的激活能力。且鲜味肽的荧光响应在较低浓度(0.25～1.0 mmol/L)下即达到较高水平,且随着浓度增加,荧光响应变化较为平稳,未出现明显的抑制现象。这表明鲜味肽在较宽的浓度范围内均能有效激活STC-1细胞,且不易产生抑制作用。MSG溶液作为单体鲜味物质,主要通过直接、快速地结合并激活T1R1/T1R3受体引发下游钙信号。然而,高浓度MSG可能因渗透压急剧升高影响细胞膜稳定性和信号传导效率,或含有的过量钠离子干扰细胞正常离子平衡,甚至可能诱发受体脱敏或轻微的细胞应激反应,从而导致荧光响应下降^[21]。相比之下,鲜味肽作为多肽分子,其与T1R1/T1R3受体的结合可能涉及更复杂的空间构象匹配,具有更高的亲和力或效能,使其在较低浓度即可有效激活受体。且多肽引发的渗透压变化相对温和,其分子特性可能使其不易诱发高浓度下的受体快速脱敏或细胞应激^[22]。通过对比鲜味肽与MSG溶液的激活效果,可以发现鲜味肽在较低浓度下即可产生与MSG相当的激活效果,且具有较好的持续感和后味。这表明鲜味肽在食品工业中具有潜在的应用价值,尤其是在低钠食品的开发中,鲜味肽可以作为一种天然的鲜味增强剂,替代部分MSG的使用。此外,鲜味肽的激活机制与MSG有所不同,其不仅能激活T1R1/T1R3受体,还能显著上调其mRNA表达量,这为进一步研究鲜味肽的呈味机制提供了新的思路。

研究表明,鲜味肽AKEKFD、LAELK和LTFVER均能显著引发STC-1细胞内钙离子荧光信号响应,这与前人研究中发现的γ-谷氨酰肽和L-谷氨酸(MSG)对STC-1细胞的激活效果相一致^[10]。此外,研究还发现3种鲜味肽溶液在0.50～8.0 mmoL/L呈现出的鲜味效果并不随着溶液浓度的增加而增加,这可能与细胞状态、荧光探针进入细胞的程度、每孔内细胞贴壁情况等相关,这一发现为鲜味肽的味觉特性研究提供了新的视角。

2.2 鲜味肽对STC-1细胞内钙离子实时荧光定量结果的影响

多功能酶标仪是一种用于生物化学和分子生物学实验的检测设备,它可以快速测量微孔板(通常是96孔或384孔板)中的荧光信号。基于此,可以绘制相应时间动力学曲线^[23]。因此本部分研究使用多功能酶标仪对STC-1细胞内钙离子荧光信号进行监测,根据反应时间绘制动力学曲线,得出钙离子荧光信号随时间变化的趋势。使用多功能酶标仪对加样后STC-1细胞内钙离子实时荧光值进行定量,钙离子实时荧光定量可以监测到最佳反应时间,并得出反应持续时长,结果见图5。鲜味肽对STC-1细胞内的钙离子荧光信号响应情况见表2。

图5 不同浓度的MSG和3种鲜味肽引起的STC-1细胞内实时钙离子荧光信号响应情况

Fig.5 Real-time Ca²⁺ fluorescence signal response within STC-1 cells at different concentrations of MSG and three types of umami peptides

表2 鲜味肽对STC-1细胞内钙离子荧光信号响应的影响

Tab.2 Effect of umami peptides on calcium ion fluorescence signal response within STC-1 cells

不同小写字母表示同列结果间具有显著性差异(P<0.05)。

相对荧光值变化大于0时,说明加入样品后STC-1细胞内钙离子的浓度增加,意味着3种鲜味肽样品能够引发STC-1细胞钙离子荧光信号响应。

由图5可以看出,MSG溶液浓度达到0.50 mmol/L时就可以引发STC-1细胞内的钙离子响应,而3种鲜味肽浓度为0.25 mmol/L时也可以引发STC-1细胞内钙离子荧光信号响应,但并非浓度越高响应程度越高,这可能与该浓度时溶液的呈味特性相关。

结合图5(a)和表2可以看出,MSG溶液浓度为4.0 mmol/L时钙离子荧光信号响应强度最高,在第20 s时响应值达到了0.677 0,但在此浓度下钙离子荧光信号响应程度呈现“陡坡”状,即迅速上升又迅速回落,在40 s左右响应强度就明显降低。而MSG溶液浓度为2.0 mmol/L时引发的钙离子荧光信号响应强度也相对较高,其持续时间相较于其他浓度而言也最长,到100 s左右才开始明显回落。当MSG溶液浓度为1.0 mmol/L时引发的钙离子荧光信号响应强度最低,在200 s左右时几乎回到零点,证明其后味不足;而溶液浓度为8.0 mmol/L时虽然引发的钙离子荧光信号响应较弱,但持续时间长,反应到200 s时其响应强度最高,证明其后味较强;溶液浓度为0.50 mmol/L和2.0 mmol/L时后味也较强,直到反应基本结束时钙离子相对荧光值还处于0.15左右。

结合图5(b)和表2可以看出,鲜味肽AKEKFD引发的STC-1细胞内钙离子荧光信号响应最大值高于MSG溶液,说明其具有更强的鲜味特性,这与之前感官评价测定其鲜味阈值以及电子舌分析的结果相一致。能够引发最强钙离子荧光信号响应的AKEKFD溶液浓度为2.0 mmol/L,且其引发的响应属于缓慢上升状态,在100 s左右时才达到最高值,但在20 s内迅速回落,证明其持续感不强;溶液浓度为0.50 mmol/L和4.0 mmol/L时引发的最高钙离子荧光信号响应值几乎持平,但4.0 mmol/L时最高值在40 s左右出现,0.50 mmol/L时最高值在100 s左右出现;溶液浓度为0.50 mmol/L的持续感最强,在反应结束时响应值最高,说明其钙离子浓度维持时间较长,能够持续激活下游信号的信息传递,因此后味也最强。相较而言,1.0 mmol/L时溶液引发的STC-1细胞内钙离子荧光信号响应最弱,但持续时间较长。溶液浓度为0.25 mmol/L时引发的钙离子荧光信号响应也较弱,持续时间大约100 s,反应结束后响应值几乎回到零点,说明其后味不足。

结合图5(c)和表2可以看出,鲜味肽LAELK引发的STC-1细胞内钙离子荧光信号响应是4组样品中最强的,其值远高于MSG溶液的最强钙离子荧光信号响应值。除了1.0 mmol/L浓度时引发的钙离子荧光信号响应最高,在50 s时达到最高值,其值远远高于其他4个浓度的样品且持续感和后味均为最强,而其余4个浓度的样品引发的钙离子荧光信号响应区别不大,其中0.50 mmo/L浓度的样品后味更强。LAELK在低浓度(1.0 mmol/L)下即展现出较强的钙离子荧光信号响应、峰值及卓越的持续感和后味,可能与其独特的分子结构特征密切相关。LAELK的氨基酸序列结构中包含2个关键的酸性氨基酸(Glu)和碱性氨基酸(Lys),这种组合可能形成有利的分子内静电相互作用或特定的空间构象,极大增强了其与鲜味受体T1R1/T1R3结合口袋的互补性和亲和力^[24]。特别是N端的疏水性氨基酸Leu和Ala,以及C端的Leu和带正电荷的Lys,可能分别与受体上的疏水口袋和正电荷区域产生多重相互作用^[25]。这种优化的结合模式不仅使得LAELK能以较低浓度(1.0 mmol/L)就高效占据并激活受体,触发强烈的初始钙信号,还可能减缓了配体-受体复合物的解离速率,或更有效地维持了受体的激活构象。而所有的5个浓度引发的STC-1细胞内钙离子荧光信号响应持续时间基本上也都维持在60 s左右,证明鲜味肽LAELK各个浓度的溶液呈鲜特性都基本一致,较为稳定。

结合图5(d)和表2可以看出,各个浓度鲜味肽LTFVER之间引发的STC-1细胞内钙离子荧光信号响应差异最大,其响应最大值与MSG溶液引发的钙离子荧光信号响应最大值几乎一致。在溶液浓度为0.50 mmol/L,时间70 s左右时钙离子荧光信号响应值达到最大,直到反应结束,其值仍维持在0.5左右,持续感和后味都非常强。溶液浓度为1.0 mmol/L时引发的钙离子荧光信号响应也比较强,持续时间也很长,在反应结束后其值也比较高,维持在0.3左右,同样持续感和后味较强。相较于0.50 mmol/L和1.0 mmol/L浓度的溶液,0.25 mmol/L浓度的溶液引发的STC-1细胞内钙离子荧光信号响应值稍低,且反应时间很短,呈现“陡坡”状,在60 s左右达到最高值,70 s时迅速回落,持续感很弱。而2.0 mmol/L和4.0 mmol/L浓度的溶液引发的钙离子荧光信号响应最大值相近,反应持续时长也相差不大,但2.0 mmol/L的溶液后味更强,在反应结束时钙离子荧光信号响应值明显大于4.0 mmol/L的溶液。

根据表2可以得出,各个样品之间引发的STC-1细胞内钙离子荧光信号响应强度各不相同,最佳浓度不同,达到最大值时反应时间不同,最大响应值也不同。使用多功能酶标仪对STC-1细胞内钙离子荧光信号进行监测,结果显示MSG溶液浓度为4.0 mmol/L时钙离子荧光信号响应强度最高。这与Saitoh等^[12]的研究结果相吻合:他们发现STC-1细胞对MSG的响应在一定浓度下达到最大值。通过综合比较不同鲜味肽的钙离子实时荧光定量结果,可以看出AKEKFD在2.0 mmol/L浓度下钙离子荧光信号最大响应值为0.738 1±0.052 9,略高于MSG溶液,但低于LAELK。LTFVER在0.5 mmol/L浓度下钙离子荧光信号最大响应值为0.677 5±0.075 4,与MSG溶液相当,但显著低于LAELK,但其钙离子荧光信号响应值维持时间最长,表明其具有较好的持续感和后味。其中鲜味肽LAELK在浓度为1.0 mmol/L时引发的钙离子荧光信号最大响应值与MSG溶液以及鲜味肽LTFVER都呈显著性差异,其值为所有4个组中的最大值(0.963 4±0.067 1),显著高于MSG溶液(0.677 0±0.032 6)和其他2种鲜味肽(AKEKFD和LTFVER),这与Yang等^[26]的研究结果相一致,他们发现某些鲜味肽能在STC-1细胞中引发强烈的钙离子响应。而Zhu等^[5]报道的凤尾鱼酱肽(如APKPK)需2.0 mmol/L才达到相似响应值。这种差异可能源于LAELK的碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸)比例较高,其正电荷更易与T1R3受体的酸性残基(如Glu301)结合^[3],从而增强受体激活效率。此外,西瓜豆酱肽的疏水性(如LTFVER含苯丙氨酸)可能延长其与受体结合时间,解释其后味持久性。这表明LAELK在较低浓度下即可产生最强的鲜味效果,具有较高的鲜味潜力。

2.3 鲜味肽对STC-1细胞鲜味受体T1R1/T1R3 mRNA表达量的影响

研究使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂进行细胞活力测定,通过CCK-8溶液与脱氢酶的氧化还原反应检测STC-1细胞的活力值。WST-8,2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5(2,4-二磺苯基)-2H-四氮唑是一种在电子偶联剂存在下,可以在较短时间内被细胞脱氢酶还原形成水溶性的橘黄色甲酰胺的化合物^[27]。在本实验中,CCK-8溶液可以被STC-1细胞中的脱氢酶还原成水溶性的橙黄色甲醛,细胞活力值与450 nm处甲醛的吸光度值成正比。

通过CCK-8实验测定STC-1细胞活力。用1.0 mmol/L浓度的3种鲜味肽溶液孵育STC-1细胞8 h,用CCK-8孵育STC-1细胞2 h,使用多功能酶标仪在450 nm处测定吸光度值。根据计算得出细胞活力值,以百分比显示。

本研究采用SPSS 16.0软件对CCK-8法测定的细胞活力数据进行统计分析。实验结果见图6,在1.0 mmol/L浓度下孵育8 h后,AKEKFD组为101.1%±8.2%,LAELK组为102.7±8.0%,LTFVER组为93.2%±6.9%。空白对照组的细胞活力为100.0%±9.3%,3种鲜味肽处理组的STC-1细胞活力与空白对照组相比均无显著统计学差异(P>0.05),证明在1.0 mmol/L浓度下孵育8 h,3种鲜味肽对STC-1细胞均无显著毒性作用,该孵育时长适合后续实验。将生长状态良好的STC-1细胞使用浓度为1.0 mmol/L的3种鲜味肽溶液进行孵育,孵育时长8 h,提取STC-1细胞内总RNA,对提取的总RNA进行浓度(A₂₆₀)和纯度(A₂₈₀)检测,所有样品的A₂₆₀/A₂₈₀及A₂₆₀/A₂₃₀比值均在可接受范围内,表明提取总RNA质量较好,可用于后续实验,提取结果见表3。

图6 孵育8 h后STC-1细胞活力

Fig.6 STC-1 cell viability after incubation for 8 h

表3 3种鲜味肽在STC-1细胞中孵育8 h后总RNA提取结果

Tab.3 Results of total RNA extraction of three types of umami peptides after incubation in STC-1 cells for 8 h

对提取出的RNA进行反转录,反转录为 cDNA,进行实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)。

实时荧光定量PCR,简称qPCR,是一种分子生物学技术,用于通过聚合酶链反应(PCR)对特定DNA或RNA模板进行定量分析。而SYBR Green I 是一种DNA结合染料,它能够与双链DNA结合并发出荧光。荧光强度与双链DNA的量成正比,其特点是操作简便,成本相对较低^[12],因此本实验选用该染料进行实时荧光定量PCR实验。已有文献证明味觉感受可以激活STC-1细胞,并使响应味觉受体被激活,mRNA表达量上调^[26]。因此本研究通过实时荧光定量PCR实验验证3种鲜味肽能否对于主要鲜味受体即T1R1和T1R3起到激活效果。实时荧光定量PCR计算结果见图7。

样品组与Control组比较,**表示有极显著性差异(P<0.01), ***表示有极其显著性差异(P<0.001)。

图7 3种鲜味肽对STC-1细胞鲜味受体T1R1和T1R3 mRNA表达量的影响

Fig.7 Effects of three types of umami peptides on mRNA expression levels of umami receptors T1R1 and T1R3 in STC-1 cells

由图7可知,相较于Control组,除LTFVER对T1R3受体没有显著作用以外,其他两个鲜味肽对于两种鲜味受体以及LTFVER对于T1R1受体都具有显著作用效果,使相应受体的mRNA表达量显著上升,证明这3种鲜味肽都可以促进鲜味受体T1R1和T1R3 mRNA的表达。

3种鲜味肽中,AKEKFD对于两种鲜味受体即T1R1和T1R3都具有极显著作用效果(P值<0.001),说明AKEKFD刺激后对于鲜味受体mRNA表达量影响极大,这与分子对接结果一致,AKEKFD与T1R1/T1R3受体的分子模拟对接实验中对接能最小,即肽段AKEKFD与T1R1/T1R3受体结合最为紧密。LAELK在分子对接中对接能中等的肽段,在本实验中,LAELK对于两种鲜味受体的mRNA也具有显著上调作用(P<0.01)。而在分子对接结果中,LTFVER为相对对接能最大的肽段,结合本次qPCR结果,可能的原因是其可以与T1R1受体部分紧密结合,即本次结果证明LTFVER对于T1R1受体mRNA表达量具有极显著上调作用(P<0.001),而其不能与T1R3结合,对于T1R3的mRNA表达量无明显上调作用,故而对接能为最大对接能,相较于AKEKFD和LAELK而言与鲜味受体T1R1/T1R3的结合不够紧密。

通过结合钙离子荧光信号响应结果与实时荧光定量PCR结果,可以更全面地理解鲜味肽对STC-1细胞的激活机制。AKEKFD和LAELK不仅能够通过激活T1R1/T1R3受体引发钙离子荧光信号响应,还能显著上调受体的mRNA表达量,进一步增强其鲜味效果。这种双重作用机制使得AKEKFD和LAELK在较低浓度下即能产生较强的鲜味效果。而LTFVER主要通过激活T1R1受体来引发钙离子响应,对T1R3受体的激活效果较弱,这可能是其鲜味效果相对温和的原因。这些结果与Zhu等^[5]的研究相呼应,他们发现从中国凤尾鱼酱中鉴定出的新型鲜味肽能够激活鲜味受体T1R1/T1R3,并增加其mRNA表达量。该研究进一步证实了鲜味肽通过激活鲜味受体T1R1/T1R3来发挥其呈味作用的机制。

3 结 论

研究通过构建STC-1细胞味觉感知模型,验证了3种鲜味肽AKEKFD、LAELK以及LTFVER的呈鲜特性。通过比对加样前后STC-1细胞内钙离子荧光信号,证明3种鲜味肽均能显著促进STC-1细胞内钙离子浓度的增加,表明其能够有效激活STC-1细胞的味觉感知机制。实时荧光定量PCR结果显示,AKEKFD在2.0 mmol/L浓度时引发最强的钙离子荧光信号响应(0.738 1±0.052 9),且能显著上调T1R1和T1R3的mRNA表达量,但其响应呈现“陡升陡降”的特征,表明其鲜味爆发力强但持久性较弱;LAELK在1.0 mmol/L低浓度即达到最高响应值(0.963 4±0.067 1),呈现出独特的“缓释型”响应曲线,且对T1R3的激活选择性更强;LTFVER则表现出明显的受体选择性,仅显著上调T1R1 mRNA表达量,而几乎不影响T1R3,在0.50 mmol/L浓度下即可引发持续200 s的长效钙响应,表现出“低强度-长持续”的特性。这一结果进一步证实了3种鲜味肽通过与鲜味受体T1R1/T1R3相互作用发挥呈鲜作用的机制。此外,研究发现鲜味肽的鲜味效果并不随溶液浓度的增加而增强,这与谷氨酸钠的呈味特性有所不同,且不同浓度的鲜味肽对STC-1细胞的激活效果存在差异,表明其呈鲜特性具有一定的浓度依赖性和特异性。研究通过细胞水平的实验验证,揭示了西瓜豆酱中3种鲜味肽的呈鲜机制及其对鲜味受体T1R1/T1R3的激活效果。希望研究能够深化对鲜味肽作用机制的理解,为食品工业开发新型天然鲜味剂提供理论参考。LAELK独特的呈味特性在未来健康食品(如减钠产品)的研发中具备深入探索的价值。

参考文献：略

制作：赵宇飞

编辑：李宁

审核：叶红波 张逸群