郑州大学于斐团队围绕CRISPR/Cas12a核酸高灵敏检测与食品水体多农药残留同步免疫筛查两大方向开展系列研究，分别从恒温级联扩增体系构建、CRISPR荧光报告探针结构优化、多靶标免疫分析技术综述三个维度产出高水平成果，相关论文相继发表于Talanta、Chemical Engineering Journal、TrAC Trends in Analytical Chemistry 等分析领域权威期刊，为低丰度生物标志物、病毒核酸及环境食品污染物的精准快速检测提供全新技术方案与理论指导。
（一）特异结构触发的CHA变体协同SDA实现CRISPR/Cas12a miRNA级联放大检测
在核酸分子诊断中，催化发夹组装（CHA）因无需热循环、可实现恒温信号放大而受到广泛关注，但传统CHA仍易出现非特异性泄漏、反应动力学较慢等问题，且为了获得更高灵敏度，往往需要引入多级酶促扩增，增加检测流程的复杂性。针对这一问题，郑州大学研究团队构建了一种结构触发型CHA变体（VCHA）协同链置换扩增（SDA）及CRISPR/Cas12a的级联检测平台，用于miRNA-155的高灵敏分析。该体系以三条发夹探针H1、H2和H3为核心：当靶标miRNA-155存在时，可依次触发探针间的识别与链置换，形成具有5′端悬垂结构的三叉复合体（5′-DTC）。这一特异性结构既提高了反应启动的选择性、抑制传统CHA的信号泄漏，又可在Klenow聚合酶作用下释放靶标miRNA，使其反复参与后续VCHA循环。随后，体系经聚合酶延伸和切口酶Nt.BbvCI切割产生两条引物，进一步启动SDA并持续生成大量单链活化DNA（acDNA）。这些acDNA能够激活Cas12a/crRNA复合物的trans切割活性，切割荧光报告探针并输出增强信号，从而实现靶标识别、结构转化与酶促放大的协同进行。实验结果表明，该平台对miRNA-155的线性检测范围为1 pM至10 nM，检出限低至0.166 pM；在人血浆及多种肺癌细胞样本中，检测结果与RT-qPCR具有良好一致性。该研究通过结构化中间体设计提升了CHA反应的可控性，为复杂生物样本中低丰度miRNA的灵敏检测提供了新思路。
图1. 基于VCHA-SDA/Cas12a系统的miRNA155检测原理
不过，该高灵敏检测性能依赖于聚合酶、切口酶和Cas12a等多种酶的协同参与，且多级扩增过程相对较长。因而，如何在减少前端扩增步骤的同时，提高Cas12a末端荧光信号输出效率，成为进一步构建简便、快速核酸检测体系的重要方向。
（二）三螺旋分子信标优化CRISPR/Cas12a荧光读出用于SARS-CoV-2高灵敏检测
在此基础上，研究者进一步将研究重点聚焦于CRISPR/Cas12a体系的荧光报告探针优化。传统CRISPR/Cas12a体系通常采用短线性单链DNA荧光-淬灭探针作为报告底物。尽管该类探针设计简单、易于应用，但其有限的链长及较为单一的空间构型，可能限制其与活化Cas12a之间的有效相互作用，进而影响切割动力学和信号响应幅度。因此，无靶标扩增策略往往面临低拷贝目标灵敏度不足的瓶颈。针对这一问题，郑州大学于斐团队进一步提出三螺旋分子信标增强型CRISPR/Cas12a检测策略，并用于SARS-CoV-2核酸的灵敏分析。该研究并未继续增加靶标扩增级数，而是将优化重点放在Cas12a的末端报告模块：以三螺旋分子信标（THMB）替代传统线性FQ探针，构建无需靶标扩增的TH-CRISPR/Cas12a检测体系。THMB由一条长链前体和一条短链茎形成寡核苷酸自组装而成，其中一部分通过Watson-Crick配对形成双链区域，另一部分则借助Hoogsteen相互作用折叠进入双链大沟，最终形成三螺旋茎与单链环结合的特殊构型。荧光基团和淬灭基团位于三螺旋茎两端，使完整探针保持较低背景；当靶序列激活Cas12a后，Cas12a高效切割THMB，破坏其构象并恢复荧光信号。实验结果表明，经环区长度、茎区长度及反应缓冲条件优化后，THMB3在相同反应条件下约二十分钟即可完成Cas12a介导的切割并达到信号平台，反应速率和荧光响应均优于传统线性单链DNA报告探针。以SARS-CoV-2的ORF1a/b和N基因为双靶标时，该平台在无靶标扩增条件下实现109 fM的检出限。进一步在伪病毒样本中，经RNA提取、逆转录及预扩增后，最低可检测至约25 copies/mL。该研究表明，通过构建更适配Cas12a切割特性的结构化报告底物，可在不额外增加前端扩增步骤的情况下提升信号转导效率，为发展快速、简便的核酸检测方法提供了新思路。
图1. THMB探针的设计及TH-CRISPR/Cas12a系统的检测原理
（三）多重免疫分析策略推动食品和水体中农药残留同步检测
在食品和水体安全监测中，农药残留往往以多组分共存形式出现，不同农药之间可能产生叠加甚至协同毒性，仅针对单一农药开展检测，难以全面反映实际暴露风险。与此同时，色谱和质谱等传统检测方法虽然具有较高准确性，但通常依赖昂贵仪器、复杂前处理及专业操作人员，难以满足现场快速筛查和大批量样本监测需求。为此，郑州大学于斐团队联合华盛顿州立大学等单位，系统梳理了基于免疫分析的多农药同步检测策略，重点评估其在食品和水体复杂基质中的应用潜力。该综述的关键在于利用抗体与农药靶标之间的特异性识别，并结合部分适配体识别策略，将不同靶标转化为可区分的空间编码或信号编码，从而在同一次检测中实现多种农药残留的同步分析。具体而言，平面微阵列可在同一基底的不同位点固定多种识别探针，使各农药对应独立的空间检测区域，悬浮微阵列则利用具有不同编码特征的微球分别负载探针，通过微球身份识别和检测信号读出实现多靶标定量；免疫层析策略可借助多试纸条、单试纸条多检测线或联合试纸条设计，实现便携、快速的现场筛查；而流动注射免疫分析及多信号标记方法，则进一步提升了检测自动化程度和信号分辨能力。
文章系统总结了上述平台在水果、蔬菜、谷物、蜂蜜、茶叶及水样中的应用，并比较了不同策略在灵敏度、检测通量、操作便捷性和抗基质干扰能力等方面的特点。研究指出，交叉反应、复杂基质干扰、识别元件稳定性及多组分定量一致性，仍是多农药免疫分析实际应用面临的主要挑战。该综述不仅为食品和水体中农药残留的高通量同步检测提供了系统参考，也为自动化、便携化和智能化食品安全监测平台的设计提供了重要思路。
相关成果
1.Yu F, Yue D, Wang F, et al. Structure-initiated cha variant coordinating sda for cascade amplification in crispr/cas12a-based mirna analysis [J]. Talanta, 2026, 304: 129558.
2.Wang Y, Zhang S, Chen J, et al. Triplex-helix molecular beacon-enabled crispr/cas12a biosensor for sensitive detection of sars-cov-2 [J]. Chemical Engineering Journal, 2026, 540: 177451.
3.Yu F, Wang F, Kwon E Y, et al. Immunoassay-based approaches for multiplex detection: A review of pesticide residues in food and water matrices [J]. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 2026, 197: 118727.
本文编辑：黎宇捷
责任编辑：牛湘衡
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