IF42.5!苏州大学&郑州大学用“国自然”荣登《Cell》顶刊!揭示AARS1乳酰化p53促癌机制!

TCGA乳腺癌数据分析显示，高乳酸信号与p53信号通路评分显著负相关。在MMTV-PyMT乳腺癌小鼠模型中，腹腔注射乳酸钠加速肿瘤发生并抑制p53活性。LDHA条件性敲除延迟肿瘤形成、降低肿瘤乳酸含量并增加p53活性（图1）。

体外实验中，乳酸或乳酸钠处理可诱导p53乳酸化，而糖酵解抑制剂2-DG或LDHA抑制剂oxamate减少p53乳酸化并增强p53靶基因表达。利用细胞裂解液而非纯乳酸直接处理p53才能降低其活性，且降低程度与乳酸化水平相关，提示存在催化乳酸化的酶。

构建p53-GFP报告基因的HeLa细胞，经乳酸和Nutlin-3处理后分选GFP高表达细胞进行CRISPR筛选，AARS1是最显著的候选基因。AARS1敲低增强p53报告基因活性和靶基因表达，抑制细胞增殖和集落形成，并阻断乳酸诱导的促肿瘤效应（图2）。

图2.全基因组CRISPR筛选鉴定AARS1为全局赖氨酸乳酸化的介导者

蛋白质组学分析显示，AARS1敲低使约80%的乳酸化肽段强度下降，而AARS1过表达使90%的乳酸化肽段强度升高。大肠杆菌EcAlaRS同样具有催化真核细胞乳酸化的能力，且与AARS1的靶点高度重叠。β-丙氨酸可有效抑制全局乳酸化。

MST分析显示EcAlaRS和HsAlaRS与乳酸的Kd分别约为13 μM和35 μM，β-丙氨酸亲和力更高并可竞争性抑制乳酸结合。分子对接鉴定出保守的乳酸结合残基，突变这些残基完全消除乳酸结合和乳酸化催化活性（图3）。

图3.AARS1直接结合乳酸并以ATP依赖方式催化赖氨酸乳酸化

体外反应需要同时存在乳酸、ATP和AARS1，且ATP结合突变体同样失活。通过去除AARS1后无法催化乳酸化，证实AARS1直接转移乳酸基团而非产生可扩散中间体。质谱鉴定出EcAlaRS催化的4,544个乳酸化位点，覆盖1,704个蛋白，乳酸化位点周围氨基酸序列具有偏好性。

蛋白质组学显示AARS1是p53的结合蛋白，Co-IP证实两者直接相互作用，Kd约为39 μM和21 μM。在细胞和体外，AARS1-WT而非乳酸或ATP结合突变体可催化p53的K120和K139位点乳酸化，并被β-丙氨酸抑制（图4）。

AARS1催化乳酸和ATP生成乳酸-AMP并释放焦磷酸，加入底物p53后乳酸-AMP被消耗并产生AMP。AARS1对乳酸的催化效率约为丙氨酸的1/2000，但细胞内乳酸浓度远高于丙氨酸，足以支持乳酸化发生。

p53的K120和K139位于DNA结合域。通过遗传密码扩展技术构建位点特异性乳酸化p53蛋白。EMSA和MST显示，p53Dual-Lac与p53RE-DNA的亲和力降低约1000倍，p53K120-Lac降低约100倍，p53K139-Lac降低约10倍（图5）。

图5.p53位点特异性乳酸化削弱其DNA结合和LLPS