文章标题：Injectable Zn²⁺-Driven carrier-free hydrogel via self-assembly of natural small molecules for liver fibrosis therapy through concurrent autophagy activation and ferroptosis inhibition
期刊：Materials Today Bio
影响因子：10.2
发表时间：2026年1月30日
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.mtbio.2026.102828
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研究创新点：
构建无载体三元水凝胶ASA Gel，通过Zn²⁺配位驱动天然小分子自组装，协同激活自噬并抑制铁死亡，实现肝纤维化精准治疗。
系统设计逻辑：
以甘草酸为凝胶骨架，Zn²⁺降低凝胶化阈值，青蒿琥酯负载其中；通过Zn²⁺-羧基配位与氢键驱动超分子自组装，形成可注射纳米纤维网络，实现肝脏靶向递送与协同调控。
肝纤维化是慢性肝损伤引发的病理性修复过程，以瘢痕组织过度沉积和肝实质结构破坏为特征。活化的肝星状细胞（HSCs）通过转分化为胶原生成肌成纤维细胞，成为驱动纤维化的核心力量。HSCs与免疫细胞的交互作用形成炎症与细胞外基质累积的自我放大环路：HSCs分泌的IL-6、TGF-β等促炎细胞因子招募巨噬细胞和中性粒细胞，持续维持HSCs活化状态。自噬作为巨噬细胞（包括库普弗细胞）的关键抗炎通路，可通过限制IL-1β产生打破这一恶性循环，激活巨噬细胞自噬具有显著抗炎和抗纤维化潜力。自噬与铁代谢的交互作用成为新研究热点，"自噬-铁死亡轴"由此成为抗纤维化的创新双靶策略。青蒿琥酯（ASA）具有优异的自噬激活活性，但水溶性差和体内脱靶分布限制了临床应用。无载体天然小分子自组装技术可将天然活性小分子直接转化为水凝胶，无需添加外源性辅料。甘草酸（GA）因独特两亲结构可自组装形成低分子量水凝胶，具备可注射性、生物降解性和组织形状适应性；锌离子（Zn²⁺）作为关键辅因子，可与GA协同降低凝胶形成阈值。
为解决上述难题，郑州大学第一附属医院周正教授、北京中医药大学徐冰教授、雷海民教授团队构建了一种新型无载体三元水凝胶（ASA Gel）。该系统通过GA、Zn²⁺与ASA的超分子自组装，GA通过葡萄糖醛酸与Zn²⁺配位形成纳米纤维网络，显著降低临界凝胶化浓度；ASA通过羧基与GA葡萄糖醛酸羟基形成氢键整合入网络。在CCl₄诱导的肝纤维化小鼠模型中，ASA Gel实现肝脏持续释药，胶原沉积减少79.99%（显著优于游离ASA组的48.19%），且无明显肝毒性。机制研究表明，ASA Gel通过协同激活HSCs自噬并抑制铁死亡发挥高效抗纤维化作用。该研究开创了机制驱动的纳米治疗范式，整合无载体递送、自噬激活与铁死亡抑制的优势，为肝纤维化临床治疗提供新思路。
方案1. ASA Gel的制备及抗肝纤维化作用机制示意图
01
ASA Gel的形态学与力学特性表征
通过GA、Zn²⁺和ASA的配位自组装制备三元无载体ASA水凝胶。将均相混合物加热至60°C后冷却至25°C，诱导快速超分子组织化，形成透明水凝胶。ASA Gel水溶液的zeta电位为-41.9±0.1156 mV，表明其因静电排斥而稳定。SEM观察显示三元ASA凝胶具有不规则纤维结构。凝胶在GA:Zn²⁺:ASA摩尔比为7:1:7时稳定、透明且塑性最佳，可在室温下通过注射器塑造成"LOVE"等多种图案和字母。流变学分析显示，ASA Gel粘度随频率增加而降低，使其可通过注射器注射；动态频率扫描显示G′值约为G″的十倍，确认其结构稳定性。结果表明ASA Gel具有完美的凝胶特性，包括粘弹性、可注射性和稳定性。
图1. ASA Gel的特性表征
FT-IR光谱提供了分子相互作用的关键信息。游离GA及GA、Zn²⁺与ASA的物理混合物中，GA的特征峰位于3233.60 cm⁻¹（-OH伸缩振动）、1722.94 cm⁻¹（C=O伸缩）、1599.11 cm⁻¹和1422.05 cm⁻¹（COO⁻不对称和对称伸缩）以及1036.83 cm⁻¹（葡萄糖醛酸C-O伸缩）。GA与Zn²⁺形成水凝胶后，-OH峰蓝移至3202.69 cm⁻¹，COO⁻峰在形状和强度上均发生显著变化，表明GA葡萄糖醛酸的羧基通过配位键与Zn²⁺结合。游离ASA呈现两个 distinct C=O伸缩峰（归因于振动耦合），而凝胶形成后仅保留1725.00 cm⁻¹处的单一残余峰；同时GA-Zn的C-O伸缩峰从1032.37 cm⁻¹移至ASA Gel的1007.80 cm⁻¹，且C=O吸收强度显著增强，表明ASA与GA-Zn通过ASA羧基与GA葡萄糖醛酸羟基之间的氢键成功组装。¹H NMR进一步验证：ASA结合后GA葡萄糖醛酸的质子峰发生显著改变，且ASA的羧基质子信号完全消失，与FT-IR数据一致，确认ASA的羧基在凝胶组装过程中与GA的葡萄糖醛酸羟基形成氢键。
为进一步阐明ASA Gel的自组装动力学，对含GA、Zn²⁺和ASA（摩尔比7:1:7）的系统进行分子动力学模拟。RMSD分析显示所有分子在20 ns后趋于稳定，表明形成稳定的聚集体。溶剂可及表面积（SASA）值在模拟过程中逐步降低，反映分子堆积密度增加和系统致密性提高。结合能分解分析确定静电相互作用和范德华力为GA与ASA自组装的主要驱动力。20 ns时分子聚集体的分子间相互作用分析显示：Zn²⁺与GA第二个葡萄糖醛酸残基的羧基形成配位键；ASA的羧基与GA第一个葡萄糖醛酸的羟基建立氢键。MD模拟清晰展示了三元自组装过程和机制，与上述实验结果一致。
为评估ASA Gel对肝纤维化及其机制的治疗作用，采用CCl₄诱导的小鼠肝纤维化模型。小鼠先给予0.1 mg/mL CCl₄ 4周诱导肝纤维化，随后分别腹腔注射GA-Zn²⁺（15 mg/kg）、游离ASA（14 mg/kg）、ASA Gel低剂量（7.25 mg/kg）、中剂量（14.5 mg/kg）和高剂量（29 mg/kg）4周，同时持续给予CCl₄。与对照组相比，模型组肝脏指数显著增加；ASA Gel不仅降低肝/体重比，还显著降低血清AST、ALT等肝功能核心指标及白蛋白、胆红素水平，表明其具有治疗效果。ASA Gel中剂量（14.5 mg/kg）和高剂量（29 mg/kg）组效果强于ASA组（29 mg/kg）。H&E染色显示，对照组肝组织结构完整清晰，肝小叶结构规则，肝细胞排列紧密有序；CCl₄处理诱导肝纤维化损伤，表现为肝细胞排列紊乱、肝小叶结构破坏、炎症浸润面积扩大和间质异常增加。ASA Gel 14.5和29 mg/kg剂量显著缓解这些组织病理学改变。定量分析显示，肝纤维化模型组炎症浸润为正常组的24倍，药物治疗均显示不同程度的改善，ASA Gel高剂量（29 mg/kg）组显著降低肝纤维化引起的炎症浸润，降低率达3.64倍。
图4. ASA Gel缓解CCl₄诱导肝纤维化小鼠的肝损伤
05
ASA Gel缓解体内肝纤维化及体外TGF-β₁诱导的LX-2细胞模型
Masson染色显示ASA Gel显著减少胶原纤维沉积，高剂量ASA Gel治疗使胶原沉积减少79.99%。Western Blot分析显示ASA Gel可抑制α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和I型胶原（COL1）蛋白表达。免疫荧光证实这些发现，显示肝窦周区域α-SMA⁺/COL1⁺细胞密度较模型组降低4.7倍，表明肝星状细胞失活化。为全面评估ASA Gel对HSCs的调控作用，体外采用TGF-β₁诱导人HSCs（LX-2细胞系）模拟肝纤维化过程。CCK-8检测显示GA-Zn、ASA和ASA Gel的IC₅₀值分别为357.6 μg/mL、177.1 μg/mL和449.9 μg/mL；在25 μg/mL浓度下，三种制剂对LX-2细胞均表现出最小细胞毒性。LX-2细胞经5 ng/mL TGF-β₁处理48 h诱导活化后，Western Blot和qPCR分析显示，TGF-β₁诱导组COL1和α-SMA蛋白水平显著上调（分别为对照组的3.35倍和3.01倍）。ASA Gel干预剂量依赖性降低这些蛋白水平：ASA Gel高剂量（25 μg/mL）组COL1和α-SMA蛋白表达降至模型组的0.37倍和0.29倍，差异极显著。qPCR结果也显示相同趋势差异。生物安全性评估通过H&E染色对多脏器进行，治疗4周后，各治疗组心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏组织与对照组相比均未观察到显著病理变化。
图5. ASA Gel缓解CCl₄诱导小鼠肝纤维化及TGF-β₁诱导的LX-2细胞系模型
06
ASA Gel通过协同激活自噬和抑制铁死亡缓解肝纤维化
RNA测序分析显示，对照组与模型组之间有7322个差异表达基因（DEGs），ASA Gel组与模型组之间有2404个DEGs。KEGG分析显示DEGs主要富集于铁死亡信号通路和自噬。ASA Gel在多层次分子谱上发挥铁死亡和自噬的双重调控作用：转录激活自噬起始机制，Atg9A mRNA水平升高2.2倍，Atg101升高2.7倍；透射电镜证实ASA Gel处理的肝细胞中观察到典型自噬结构，自噬囊泡显著增加，代表自噬流增强。免疫荧光定量分析显示模型组P62荧光强度较对照组增加1.69倍，表明自噬体-溶酶体融合显著受阻；ASA Gel高剂量（29 mg/kg）治疗显著降低P62荧光强度，表明ASA Gel具有促进自噬的作用。qPCR分析显示ASA Gel处理小鼠肝组织中GPX4上调2.4倍，SLC7A11增加1.8倍，确认铁死亡受到抑制。体外实验同样证实ASA Gel通过调控自噬和铁死亡发挥抗肝纤维化作用：TGF-β₁组中铁死亡标志物GPX4、SLC7A11和自噬相关标志物P62的蛋白表达显著改变，ASA Gel处理以浓度依赖性方式逆转这些变化，ASA Gel高剂量（25 μg/mL）组GPX4和SLC7A11分别增至TGF-β₁组的3.13倍和3.66倍，P62降至TGF-β₁组的2.85倍。Western Blot和qPCR结果共同确认ASA Gel在蛋白和转录水平上调控HSCs活化状态，从而发挥抗肝纤维化作用。
图6. 不同组小鼠肝脏的RNA表达谱
图7. ASA Gel通过协同激活自噬和抑制铁死亡缓解肝纤维化
图8. 体外实验中ASA Gel通过激活自噬和铁死亡通路缓解TGF-β₁诱导的肝纤维化
07
ASA Gel在肝纤维化模型小鼠中实现肝脏靶向递送
为阐明ASA Gel的体内分布特征，使用DiR-ASA Gel评估其体内分布。结果显示游离DiR与DiR-ASA Gel的生物分布存在显著差异。肝纤维化过程中，肝脏病变区域的增强渗透和滞留（EPR）效应导致游离DiR和DiR-ASA Gel均在肝脏被动累积。具体而言，游离DiR组约8 h达峰后迅速下降，而DiR-ASA Gel组荧光信号在12 h达峰且更集中于肝脏区域。定量分析显示，相同时间点DiR-ASA Gel的荧光表达为游离DiR的两倍以上，12 h时为游离DiR的4.2倍。48 h后各器官独立荧光成像显示荧光集中于肝脏、脾脏和肺部；48 h时DiR-ASA Gel在肝脏的荧光强度为游离DiR的两倍。脾脏中的非特异性累积和肺部的微量分布是纳米载体在体内的正常行为，不影响肝脏的富集优势。与游离DiR相比，DiR-ASA Gel能更有效地靶向并累积于肝纤维化模型小鼠的病变肝脏，且在肝脏的滞留时间显著延长。
图9. ASA Gel在肝纤维化模型小鼠中实现肝脏靶向递送
本研究通过配位介导的氢键作用，将GA、Zn²⁺和ASA合成三元无载体ASA Gel水凝胶，形成具有优异生物相容性的协同治疗三联体。在CCl₄诱导的肝纤维化小鼠中，ASA Gel展现出良好的治疗效果，可显著降低血清ALT、AST及白蛋白、胆红素等肝功能核心指标，降低α-SMA、COL1纤维化标志蛋白表达，缓解胶原沉积。肝脏转录组学和体内研究揭示了ASA Gel对自噬-铁死亡的双重调控：ASA Gel可上调自噬体组装基因Atg9A和Atg101，促进自噬体形成并增强自噬流；同时上调GPX4和SLC7A11表达，挽救肝细胞免于铁死亡。该自组装水凝胶平台协同植物化学生物活性与金属离子配位，通过自噬增强和氧化还原稳态恢复提供精准抗纤维化治疗，为肝纤维化临床治疗提供了新的见解和策略。
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