乳制品行业是全球主要的新兴工业领域之一，主要是对原料乳进行加工以生产各种食品，如奶酪、酸奶、黄油等。乳清是乳制品工业的主要液态副产品，其主要成分为乳清蛋白，其中β-乳球蛋白（β-Lg）含量最高。β-Lg因具有较高的营养价值与良好的发泡、乳化和胶凝特性，被广泛用作肉制品、鱼制品、甜点、烘焙食品和其他食品生产中的加工助剂。然而，β-Lg具有较强的致敏性，限制了过敏人群的饮食选择。常规消减蛋白致敏性的方法（如酶解和加热等）易对蛋白的功能特性造成不良影响。因此，开发能够有效改善蛋白功能特性并可能降低其致敏性的新型加工技术具有重要意义。

糖基化是一种蛋白质化学修饰方法，其中还原糖的羰基与蛋白质的游离氨基共价结合，这种修饰可引入亲水基团并影响氨基酸残基间的非共价相互作用，从而改变蛋白结构和功能特性。Cao Ruiqi等使用兔肌原纤维蛋白与3种糖（葡萄糖、乳糖和β-葡聚糖）分别进行糖基化，发现单糖在提高蛋白质溶解度和抗氧化活性方面表现出优异的功效，而多糖在增强蛋白热稳定性、乳化和发泡性能方面表现出更明显的效果。传统的糖基化策略为湿热法和干热法，这两种方法都需要较长的反应时间和较高的能量消耗。因此，亟需开发高效、温和的糖基化反应新途径。

介质阻挡放电（DBD）是一种典型的产生低温等离子体技术，其核心是在电极间插入绝缘介质，可以在常温常压下产生高能电子、紫外线及多种活性粒子，如活性氧（ROS）和活性氮（RNS）等。这些活性物质能有效蚀刻蛋白质表面，破坏共价键，为糖基化反应提供活化能，同时诱导蛋白质发生氧化、交联等结构变化，是一种极具潜力的蛋白质绿色改性技术，具有易于操作、在常压室温下工作、可控、低温和高效产生反应性物质的优势。本课题组前期的研究表明，DBD等离子体可以在几分钟内促进β-Lg发生糖基化，且可以显著降低β-Lg的抗原性至原来的64.9%。另有研究表明，等离子体辅助糖基化能使虾原肌球蛋白的潜在致敏性降低30%。此外，有研究表明，冷等离子体处理不仅能直接改善蛋白质的功能特性，还可通过促进蛋白质糖基化而进一步改变其功能特性。米糠蛋白经微波等离子体（160 W）处理5 min后，其溶解度、乳化活性、乳化稳定性、起泡性、泡沫稳定性和持水、持油能力等功能特性均达到最大值。DBD等离子体在功率70 W条件下处理1.5 min使葡聚糖与花生分离蛋白之间发生反应，糖基化程度达到21.6%，产物的溶解性和乳化性得以增强。然而，目前国内外对等离子体辅助糖基化的研究多针对液体体系，仍缺乏对样品处于液态和固态时反应程度与改性效果差异的系统对比。此外，乳糖作为牛乳中含量最多的糖类，在等离子体处理牛乳过程中极易与乳蛋白发生糖基化，其中的糖蛋白功能特性变化仍有待探索。

鉴于此，郑州轻工业大学食品与生物工程学院的翟娅菲、汤国新、相启森*等以β-Lg和乳糖为研究对象，系统分析DBD等离子体辅助糖基化处理对β-Lg溶液和β-Lg粉末结构和功能特性的影响，重点从糖基化程度和分子结构变化角度阐释液/固体系差异的机制，以期为等离子体辅助糖基化技术在蛋白质改性方面的应用提供理论依据。

1 糖基化程度

2 SDS-PAGE分析

通过还原性SDS-PAGE分析了DBD等离子体辅助糖基化对β-Lg样品分子质量分布的影响。天然β-Lg的单体理论分子质量约为18.4 kDa，对应15～25 kDa的主条带，更高分子质量区域的条带表明该商业样品中含有除β-Lg单体外的其他组分。如图2所示，与未处理组（泳道1）相比，所有处理组（泳道2～9）的β-Lg条带上移且呈弥散状态，表明β-Lg和乳糖共价结合，形成了分子质量更高的糖与蛋白质复合物。这一现象与Jia Chengli等的研究结果一致：高静水压辅助β-Lg与低聚半乳糖发生糖基化反应产生的蛋白条带较天然β-Lg的条带明显上移。在＞35 kDa的高分子质量区域，其条带灰度有所增强，说明形成了高分子质量复合物，证明了蛋白间共价交联反应的发生。与固体样品相比，DBD等离子体处理的液体样品能产生更高分子质量的蛋白，且随着处理时间的延长产生的蛋白分子质量越大。说明DBD等离子体处理更容易使液体状态的蛋白发生糖基化，糖基化程度随着DBD等离子体处理时间的延长而增加，这与糖基化程度的结果相印证（图1）。

3 圆二色光谱分析

远紫外区域的圆二色光谱谱带可通过比较其特征峰的位置和强度，从而分析蛋白质二级结构变化。如图3A、B所示，未处理的β-Lg在214 nm波长处有负峰，表明β-折叠结构占主导。通过计算蛋白质二级结构相对含量可知，随着DBD等离子体辅助糖基化处理时间的延长，β-Lg的α-螺旋和无规卷曲相对含量显著下降（P＜0.05），β-折叠相对含量显著增加（P＜0.05）（图3C、D）。β-折叠含量的增加可能是由于糖基化程度的提高促进了氢键的形成，从而增强了共轭物的有序结构。Sharafodin等认为，α-螺旋相对含量的减少和β-折叠相对含量的增加是蛋白质聚集体形成的表现，这与本研究中的SDS-PAGE结果相符。液体组变化更为显著，这与更高程度的糖基化修饰和更剧烈的结构扰动密切相关。同样地，Jia Chengli等发现，β-Lg经高静压协同糖基化处理后，α-螺旋的相对含量下降，β-折叠的相对含量升高。Wang Fengqi等发现，虾原肌球蛋白在经DBD等离子体和糖基化处理后也出现相同的二级结构变化趋势。

4 内源荧光光谱及紫外吸收光谱分析

采用内源荧光光谱评估芳香族氨基酸（如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）所处微环境的改变，从而分析DBD等离子体辅助糖基化处理对β-Lg结构的影响。如图4A、B所示，天然β-Lg在334 nm波长处的荧光强度最大，经处理后固体组和液体组的最大发射波长均未发生明显偏移。随着处理时间的延长，β-Lg的荧光强度逐渐降低，并且固体组的荧光强度变化比液体组小，说明处理后的β-Lg三级结构发生变化，更多芳香族氨基酸被包埋在蛋白质内部或被氧化，从而使荧光强度下降。Zhou Renwu等通过高分辨质谱证实常压空气微等离子体处理会优先氧化芳香族氨基酸残基（酪氨酸和苯丙氨酸），使其芳香环和侧链羟基化和硝基化，最终导致内源荧光的猝灭。Zhang Yongniu等也发现，DBD等离子体处理会氧化酪氨酸使其内源荧光强度下降。

进一步测定了β-Lg紫外吸收光谱以反映酪氨酸和色氨酸残基所处微环境的变化。如图4C、D所示，未经处理的β-Lg在277 nm波长处有最大吸收强度。经DBD等离子体处理后，液体组β-Lg的最大吸收波长发生蓝移，从277 nm移至270 nm，且最大吸收峰强度下降；而固体组β-Lg的最大吸收波长发生红移，从277 nm移至279 nm，最大吸收强度亦下降。液体组的最大吸收波长蓝移表明这些芳香族氨基酸残基可能被包埋到蛋白质分子内部更疏水的环境中，其微环境极性减弱；而固体组的红移则表明更多的芳香族氨基酸残基暴露到水环境中，其所处的微环境极性增强，蛋白质结构可能变得更加松散。两者吸收强度的下降均可能与等离子体诱导的芳香族氨基酸氧化有关。紫外吸收光谱的结果与内源荧光光谱结果相互印证，共同揭示了DBD等离子体辅助糖基化处理对β-Lg三级结构具有显著影响，且液、固体系的变化模式存在差异。

5 表面疏水性分析

表面疏水性可以反映蛋白质表面疏水基团的分布，其变化可用于监测蛋白质构象的变化。表面疏水性和构象在蛋白质的乳化特性中起着至关重要的作用。如图5所示，随着处理时间的延长，液体样品的表面疏水性从3 161.42显著下降至1 480.52（P＜0.05）。在处理0.5 min和1.5 min时固体样品表面疏水性变化不显著，在处理3.5 min时表面疏水性显著下降至2 589.05（P＜0.05），但下降程度低于液体组。这可能是因为随着DBD等离子体辅助糖基化处理时间的延长，β-Lg的糖基化程度逐渐增加，连接到蛋白表面的乳糖增加了蛋白的亲水性，以及糖链的空间位阻作用阻断了疏水性氨基酸和ANS疏水探针间的连接，从而导致表面疏水性降低。此外，DBD等离子体处理产生的ROS会氧化氨基酸残基的侧链，形成羰基等亲水基团，使其表面疏水性下降、亲水性增强。与固体组相比，液体组样品的表面疏水性下降更为明显，这可能是因为液体组的糖基化程度较高，分子表面被乳糖覆盖的位点更多，从而对ANS探针产生了更广泛的屏蔽作用。此外，液体环境为ROS提供了均一且高效的反应介质，使其能与蛋白质分子发生更充分的氧化反应，降低其表面疏水性。类似地，Ma Yue等发现超声预处理促进了α-乳清蛋白与木糖发生糖基化，并显著降低了其表面疏水性。Zhang Yongniu等发现，经DBD等离子体处理后酪蛋白的酪氨酸、苯丙氨酸、氨基酸骨架上NH2基团或侧链上—NH等疏水基团会被ROS氧化形成羰基（亲水基团），使其表面疏水性下降、亲水性增强。

6 热稳定性分析

使用差示扫描量热法评估DBD等离子体辅助糖基化处理后β-Lg的热稳定性。如图6所示，未处理β-Lg的变性温度为69.96 ℃，在DBD等离子体辅助糖基化处理1.5 min时液体组样品的变性温度达到最大值（77.93 ℃），其他处理时间样品的变性温度较未处理组也均显著提升（P＜0.05）；固体组样品的变性温度在处理时间超过1.5 min时显著提升（P＜0.05）。说明等离子体辅助糖基化处理增强了β-Lg的热稳定性。处理后β-Lg热稳定性的提升可能与乳糖的共价连接有关，其通过增加蛋白质分子的刚性并增强分子间氢键网络，从而提高了蛋白质展开所需的能量。液体组样品在处理1.5 min时出现峰值，而后略有下降，这可能与持续的等离子体处理导致色氨酸、酪氨酸等关键氨基酸的氧化破坏了芳香环间的相互作用相关，也可能源于等离子体处理引起的化学蚀刻作用削弱了维持蛋白质结构的关键作用力，导致变性温度下降。固体组未出现明显峰值，可能是因为其反应温和缓慢，在整个处理时间内，等离子体处理尚未削弱蛋白内的作用力。

7 溶解度分析

如图7所示，D B D等离子体辅助糖基化处理后固体组的β-Lg溶解度随着处理时间的延长显著升高（P＜0.05），处理3.5 min时，溶解度从7.91 mg/mL增至9.44 mg/mL，增幅为19.3%。液体组β-Lg的溶解度最大值出现时间提前至1.5 min，此时β-Lg的溶解度从7.91 mg/mL显著提升到9.96 mg/mL（P＜0.05），增幅为25.9%，随后趋于稳定。且相同处理时间条件下，液体组的溶解度高于固体组。在处理前期，等离子体处理促进了蛋白质与乳糖之间的共价键形成，共价连接的乳糖在蛋白质表面形成亲水层，极大地增强了水合作用，促使溶解度快速上升，而液体组的糖基化程度高于固体组，使液体组β-Lg具有更强的亲水性和溶解度，这与β-Lg的表面疏水性变化结果相印证。然而，随着处理时间延长，等离子体诱导的氧化交联反应逐渐增强，导致可溶性糖基化产物进一步转化为分子质量更大、溶解度较低的聚集体。当新生成的可溶性产物量与被消耗形成聚集体的量达到动态平衡时，尽管糖基化程度仍在缓慢增加，但宏观的溶解度不再显著提升。

8 乳化活性和乳化稳定性分析

蛋白质的乳化特性由其两亲性驱动。EAI和ESI是反映蛋白质乳化特性的两个常见指标。前者代表蛋白质吸附到油-水界面的能力，后者代表蛋白质在规定时间内在油-水界面的保留能力。如图8所示，β-Lg的EAI和ESI均随着等离子体辅助糖基化处理时间的延长而显著增强（P＜0.05）。处理3.5 min时，液体组样品的EAI从29.39 m2/g提升到48.17 m2/g，增幅为63.9%，ESI从14.93 min提升到24.80 min，增幅为66.1%。而在相同处理时间下，固体组样品的EAI提高了48.3%，ESI提高了40.1%。有研究表明，较高的表面疏水性会降低蛋白质在水中的溶解度，限制蛋白质迁移到界面的能力，促进蛋白质-蛋白质相互作用并形成蛋白聚集，这可能导致不理想的乳化效果。而DBD等离子体辅助糖基化处理使β-Lg的溶解度增大、表面疏水性降低，蛋白质能够快速迁移到油-水界面并具有在界面膜处重排的灵活性。共价连接的乳糖具有高度的亲水性和柔性，在吸附到油-水界面后，这些糖链会深入水相形成一个致密的“糖层”，糖基化蛋白的蛋白质部分则锚定在疏水界面。糖链能在油滴间产生显著的空间位阻排斥作用并伴随静电排斥效应，以防止絮凝和聚结，从而增强了乳液的长期稳定性。

9 体外消化性分析

一些研究报道β-Lg对胃蛋白酶水解具有较高的抵抗力，但对胰蛋白酶敏感，本研究也发现了相同结果。如图9所示，模拟胃消化的120 min内β-Lg水解缓慢，而在开始模拟肠消化的60 min内消化率迅速提高，之后随模拟消化时间延长消化率趋于稳定。等离子体辅助糖基化可促进β-Lg在模拟消化过程中的水解。模拟消化结束时，经等离子体辅助糖基化处理2.5 min的液体β-Lg可使其消化率提升至83.7%，较未处理β-Lg提高了21.5%；而处理3.5 min的固体β-Lg消化率提升至78.9%，较未处理β-Lg提高了16.7%。

β-Lg在酸性条件下结构稳定，其胃蛋白酶水解位点（疏水性或芳香族氨基酸侧链）深埋于特征性β-桶状结构内部，形成强疏水核心，抑制了水解作用，导致了较低的胃蛋白酶水解度。等离子体辅助糖基化处理使β-Lg的结构特性和疏水性发生变化，改变了蛋白质的电荷分布与空间构象，使蛋白质结构松散，暴露出原本包埋的酶切位点，从而增加了β-Lg被胃蛋白酶水解的程度。胰蛋白酶优先切割赖氨酸和精氨酸残基的羧基侧，糖基化通常也发生在赖氨酸和精氨酸残基上，然而等离子体辅助糖基化并没有抑制胰蛋白酶对β-Lg的酶解，反而提高了其水解度。Zou Sang等通过质谱等手段分析发现，DBD等离子体辅助糖基化处理除了可改变虾原肌球蛋白的结构，还可增加其胰蛋白酶的切割位点数量及切割效率，从而降低蛋白的消化稳定性。尽管部分赖氨酸残基因参与糖基化而被“屏蔽”，但等离子体辅助糖基化引起的蛋白质构象重排可能使更多原本不可及的赖氨酸和精氨酸残基暴露出来，从而提升了消化率。消化率的显著提升不仅意味着蛋白质生物利用度的提高，也表明其致敏性可能降低，因为更彻底的酶解意味着更多的潜在致敏表位可被破坏。

10 结论

本实验使用DBD等离子体对液态和固态的β-Lg和乳糖混合物进行处理，研究改性处理对β-Lg的结构和功能特性的影响。结果发现，DBD等离子体处理可在短时间内促进蛋白与糖的液体混合物及固体混合物发生糖基化，其糖基化程度与处理时间呈正相关，且液体组的糖基化程度高于固体组。从结构表征来看，经此处理后β-Lg的表面疏水性、α-螺旋和无规卷曲结构的相对含量降低，表明其结构发生改变。在功能特性方面，DBD等离子体辅助糖基化处理显著提升了β-Lg的热稳定性、溶解度、乳化活性、乳化稳定性以及体外消化性，且液体组的功能特性提升优于固体组。本实验通过DBD等离子体辅助糖基化引起的β-Lg结构变化进一步阐明了引起其功能特性与消化率提升的机制，证实了DBD等离子体技术在蛋白质改性中的应用潜力，可为β-Lg的高值化利用和开发基于β-Lg的低致敏性食品提供理论依据与实践参考。