郑州大学第一附属医院 | 突破慢性术后痛治疗瓶颈!ACC-CaMKII-AcbC 通路为靶点,解锁疼痛调控新机制

导读：

为探究慢性术后痛（CPOP）的神经环路机制，本研究采用皮肤 / 肌肉切开牵拉（SMIR）模型模拟 CPOP，通过免疫荧光、在体电生理、光纤 photometry、化学遗传学和光遗传学等技术，发现伏隔核核心区（AcbC）神经元在 SMIR 小鼠中异常激活，且接收前扣带回皮层（ACC）CaMKII 阳性神经元的兴奋性投射；抑制 AcbC 神经元或 ACC-CaMKII-AcbC 通路可缓解 SMIR 小鼠的机械痛敏，激活该神经元或通路则在正常小鼠中诱导疼痛表型，证实 AcbC 神经元及 ACC-CaMKII-AcbC 通路在 CPOP 发病中起关键作用，为术后疼痛治疗提供了潜在靶点。

注：该文章发表于《iScience》，该期刊五年影响因子4.7，JCR一区，中科院二区。

研究结果

• SMIR 小鼠术后 1-14 天同侧后爪 PWT50 显著降低，仅表现为机械痛敏，无热痛敏，且运动功能不受影响；AcbC 区 C-FOS 阳性神经元数量显著增加，且对侧多于同侧，C-FOS 阳性细胞与 D1R-MSNs 共定位比例（52.97%±11.03%）高于 D2R-MSNs（37.52%±5.15%），电生理显示 AcbC 神经元放电频率升高。

• 光纤 photometry 证实，SMIR 小鼠 AcbC 神经元对 0.6g 和 2g 机械刺激的钙信号反应均显著增强，C-FOS 与 GCaMP 存在共定位。

• 病毒追踪显示，AcbC 神经元接收 ACC 区 CaMKII 阳性神经元的直接投射，尤其来自 ACC 的 Cg2 亚区。

• 化学遗传学抑制 AcbC 神经元可升高 SMIR 小鼠同侧 PWT50，激活则降低正常小鼠 PWT50 和 PWL；激活 ACC-CaMKII 神经元可增强 AcbC 神经元钙信号和放电频率，SMIR 小鼠 ACC-CaMKII-AcbC 通路对机械刺激的反应增强。

• 光遗传学抑制 ACC-CaMKII-AcbC 通路可缓解 SMIR 小鼠机械痛敏，激活则诱导正常小鼠出现机械痛敏和热痛敏，且不影响运动功能。

Figure 1：SMIR 小鼠伏隔核核心区（AcbC）神经元显著激活

该图通过一系列实验验证了皮肤 / 肌肉切开牵拉（SMIR）模型构建后，AcbC 神经元的激活状态。首先，行为学测试显示 SMIR 小鼠术后 1-14 天同侧后爪的 50% 足退缩阈值（PWT50）显著降低，仅表现为机械痛敏，而热痛敏（PWL）无明显变化，且开放场试验证明手术未影响小鼠运动功能。随后，免疫荧光染色发现 SMIR 小鼠 AcbC 区的 C-FOS 阳性神经元数量显著增加，且对侧 AcbC 的 C-FOS 阳性细胞密度高于同侧，提示神经损伤后存在偏侧化神经元激活模式，同时 C-FOS 阳性细胞与 D1R-MSNs 的共定位比例（52.97%±11.03%）高于 D2R-MSNs（37.52%±5.15%）。此外，在体电生理记录显示 SMIR 小鼠 AcbC 神经元的自发放电频率较假手术组显著升高，综合这些结果证实 SMIR 手术可诱导 AcbC 神经元异常激活，表现为细胞活性增强。

Figure 2：SMIR 小鼠 AcbC 神经元对非伤害性和伤害性刺激的反应增强

此图通过光纤 photometry 技术监测自由活动小鼠的 AcbC 神经元钙信号，探究其对不同机械刺激的响应特性。实验中向小鼠对侧 AcbC 注射 AAV2/9-hSyn-GCaMP6s 病毒并植入光纤，分别用 0.6g（非伤害性）和 2g（伤害性）von Frey 丝刺激后，结果显示假手术组中 0.6g 刺激仅引发 AcbC 神经元轻微钙瞬变，而 SMIR 小鼠的钙信号反应显著增强；2g 刺激下两组均出现钙活性升高，但 SMIR 组的反应幅度远大于假手术组。对曲线下面积（AUC）的定量分析进一步证实，SMIR 组在两种刺激下的钙信号强度均显著增加，且免疫组化结果显示 SMIR 组中 GCaMP 阳性神经元与 C-FOS 阳性细胞存在共定位，表明 SMIR 手术导致 AcbC 神经元处于过度兴奋状态，对非伤害性和伤害性机械刺激的反应性均显著提升。

Figure 3：AcbC 神经元双向调控疼痛敏感性

该图借助化学遗传学技术（DREADDs）探究 AcbC 神经元在疼痛调节中的作用。在 SMIR 小鼠对侧 AcbC 注射 AAV2/9-hSyn-hM4D (Gi)-EGFP 病毒后，腹腔注射氯氮平 N - 氧化物（CNO）可有效抑制 AcbC 神经元活性（表现为 C-FOS 阳性细胞减少），并特异性升高 SMIR 小鼠同侧后爪的 PWT50，缓解机械痛敏，且不影响热痛敏和运动功能。反之，向正常小鼠左侧 AcbC 注射 AAV2/9-hSyn-hM3D (Gq)-EGFP 病毒后，CNO 激活 AcbC 神经元会显著降低正常小鼠右侧后爪的 PWT50 和 PWL，诱导疼痛表型，同时不影响运动表现。这些结果表明 AcbC 神经元具有双向疼痛调控作用，激活可诱导伤害性超敏反应，抑制则能减轻机械痛敏。

Figure 4：AcbC 神经元接收前扣带回皮层（ACC）CaMKII 阳性神经元的投射

此图通过病毒追踪技术明确了 ACC 与 AcbC 之间的神经连接。首先向 CaMKII-Cre 小鼠双侧 ACC 注射 AAV2/9-EF1α-mCherry-DIO 病毒，组织学分析发现 ACC 内出现 mCherry 阳性神经元胞体，且 AcbC 区存在 mCherry 标记的神经纤维，提示 AcbC 接收 ACC CaMKII 神经元的投射。为进一步验证直接连接，向双侧 ACC 注射 CRE 依赖的顺行跨突触病毒 AAV2/1-CaMKIIα-CRE，同时向 AcbC 注射 DIO 依赖的逆行追踪病毒 AAV2/Retro-hSyn-mCherry-DIO，结果显示 AcbC 内出现 mCherry 阳性轴突末梢和神经元胞体，且 ACC 内的 mCherry 阳性神经元主要定位于 Cg2 亚区。这些实验证实 AcbC 神经元可接收来自 ACC（尤其是 Cg2 亚区）CaMKII 阳性神经元的直接突触输入。

Figure 5：ACC CaMKII 阳性神经元对 AcbC 神经元起正向调控作用

该图结合化学遗传学与光纤 photometry、在体电生理技术，探究 ACC CaMKII 神经元对 AcbC 神经元活性的调控功能。向 ACC 注射 AAV2/9-CaMKIIα-hM3D (Gq)-mCherry 病毒，同时向同侧 AcbC 注射 AAV2/9-hSyn-GCaMP6s 病毒，CNO 激活 ACC CaMKII 神经元后，AcbC 神经元的钙信号峰值数量显著增加；在体电生理记录进一步显示，激活 ACC CaMKII 神经元可显著升高 AcbC 神经元的自发放电频率，且峰间间隔（ISI）显著缩短，多数 ISI 低于 0.03s。钙成像与电生理结果共同证实，ACC CaMKII 神经元通过直接的兴奋性投射，对 AcbC 神经元活性起到正向调控作用。

Figure 6：SMIR 手术增强 ACC CaMKII-AcbC 通路对机械刺激的反应

此图通过光纤 photometry 监测 SMIR 手术对 ACC CaMKII-AcbC 通路活性的影响。向 ACC 注射 AAV2/1-CaMKIIα-mCherry-CRE 顺行跨突触病毒，向同侧 AcbC 注射 AAV2/9-hSyn-GCaMP6s-DIO 病毒，使接收 ACC 投射的 AcbC 神经元表达 GCaMP6s，随后植入光纤记录钙信号。结果显示，0.6g von Frey 丝刺激下，SMIR 组接收 ACC 投射的 AcbC 神经元钙活性显著升高，而假手术组反应微弱；2g 刺激下两组均出现钙活性增加，但 SMIR 组的反应幅度显著大于假手术组。曲线下面积分析证实，SMIR 组在两种刺激下的钙信号强度均显著高于假手术组，表明 SMIR 手术可增强 ACC CaMKII-AcbC 通路对非伤害性和伤害性机械刺激的反应活性。

Figure 7：ACC CaMKII-AcbC 兴奋性通路双向调控疼痛

该图利用光遗传学技术明确 ACC CaMKII-AcbC 通路在疼痛调节中的作用。向 SMIR 小鼠对侧 ACC 注射 AAV2/1-CaMKIIα-eNpHR3.0-mCherry-CRE 病毒，向同侧 AcbC 注射 AAV2/9-hSyn-mCherry-DIO 病毒并植入光纤，594nm 光刺激可抑制该通路活性（表现为 C-FOS 阳性细胞减少），并特异性升高 SMIR 小鼠同侧后爪的 PWT50，缓解机械痛敏，且不影响热痛敏和运动功能。反之，向正常小鼠左侧 ACC 注射 AAV2/1-CaMKIIα-hChR2-mCherry-CRE 病毒，向同侧 AcbC 注射 AAV2/9-hSyn-mCherry-DIO 病毒，473nm 光刺激激活该通路后，正常小鼠右侧后爪的 PWT50 和 PWL 显著降低，诱导疼痛表型，且运动功能不受影响。这些结果表明 ACC CaMKII-AcbC 通路可双向调控疼痛敏感性，抑制通路能缓解 CPOP 相关机械痛敏，激活则可诱导正常小鼠出现疼痛反应。

Figure 8：ACC CaMKII-AcbC 通路激活参与慢性术后痛（CPOP）的示意图

该图以示意图形式直观呈现了 ACC CaMKII-AcbC 通路在 CPOP 发生中的作用机制。在无 CPOP 状态下，AcbC 神经元和 ACC CaMKII-AcbC 通路处于静息状态，疼痛信号正常调控；而在 CPOP 状态下，SMIR 手术诱导 ACC CaMKII 神经元激活，通过兴奋性投射增强 AcbC 神经元的活性，进而引发机械痛敏等疼痛表型。该示意图清晰概括了研究核心结论：ACC CaMKII-AcbC 通路的激活是 CPOP 发生发展的关键机制，为理解 CPOP 的神经环路基础提供了直观参考。