郑州大学附属肿瘤医院 | 揭秘 USP25 在头颈鳞癌中的关键作用:逆转免疫抑制微环境,为免疫治疗添新靶点

为探究去泛素化酶在头颈鳞癌（HNSCC）肿瘤免疫微环境（TIME）中的作用，通过生物信息学筛选差异表达去泛素化酶，发现 USP25 在 HNSCC 中低表达且与不良预后相关；进一步结合单细胞测序、体内外功能实验及机制研究，证实 USP25 通过 UIM2 结构域结合 TAB2 并去除其 K63 连接泛素链，抑制 MAPK 通路激活及 IL-6 分泌，从而减少髓系来源抑制细胞（MDSCs）迁移、促进 CD8+T 细胞浸润，逆转免疫抑制微环境；最终发现 USP25 过表达可增强 HNSCC 对 PD-1 抑制剂的敏感性，为 HNSCC 免疫治疗提供新靶点。

注：该文章发表于《Cell Death Discovery》，该期刊最新影响因子为7.0，JCR分区Q1，中科院生物学大类2区。

首次揭示 USP25 在 HNSCC 免疫微环境中的调控作用，明确其通过结合 TAB2 去除 K63 泛素链抑制 MAPK-IL-6 通路，调控 MDSCs 与 CD8+T 细胞浸润平衡；证实 USP25 低表达与 HNSCC 不良预后相关，且过表达可增强抗 PD-1 治疗敏感性，为 HNSCC 预后评估及免疫治疗联合靶点开发提供全新思路。

采用多组学生物信息学分析，从 TCGA、GEO 数据库筛选 HNSCC 与正常组织中差异表达的去泛素化酶，通过 GEPIA2、Kaplan-Meier Plotter 分析 USP25 的预后价值；构建 4-NQO 诱导的 HNSCC 小鼠模型及 MOC1 同源肿瘤模型，结合 USP25 过表达 / 敲低细胞系，通过 CCK8、Transwell、伤口愈合实验检测细胞功能；利用单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）解析肿瘤免疫微环境细胞组成；通过免疫沉淀（Co-IP）、免疫荧光共定位、泛素化实验验证 USP25 与 TAB2 的相互作用及去泛素化机制；采用 IHC、mIHC 检测组织中 USP25、CD8+T 细胞、MDSCs 浸润水平；通过体内抗 PD-1 治疗实验评估 USP25 对免疫治疗疗效的影响；运用 ELISA、Western blot 检测细胞因子分泌及通路蛋白表达。

生物信息学分析显示，USP25 是 HNSCC 中唯一与不良预后相关的低表达去泛素化酶，其表达水平与 CD8+T 细胞浸润正相关、与 MDSCs 浸润负相关；体内实验证实 USP25 低表达促进 HNSCC 进展及淋巴结转移，过表达则缩小肿瘤体积；单细胞测序表明 USP25 低表达组存在免疫抑制性微环境，CD8+T 细胞比例降低、MDSCs 积累；机制研究发现 USP25 通过 UIM2 结构域结合 TAB2，去除其 K63 连接泛素链，抑制 MAPK 通路激活及 AP-1 介导的 IL-6 分泌，进而减少 MDSCs 迁移；功能实验显示 USP25 过表达可增强 T 细胞增殖及 IFN-γ 分泌，减弱 MDSCs 的免疫抑制作用；体内抗 PD-1 治疗实验证实，USP25 过表达组肿瘤对 PD-1 抑制剂敏感性显著提高，肿瘤内功能型 CD8+T 细胞比例增加、MDSCs 积累减少。

Figure 1：USP25 在 HNSCC 中低表达且与不良预后相关

该图通过多维度分析明确了 USP25 在 HNSCC 中的表达特征及临床意义。首先，通过 Venn 图和小提琴图从 TCGA、GEO 等数据库的 95 种去泛素化酶中，筛选出 HNSCC 与正常组织中 2 种显著下调（USP25、UBL3）和 10 种显著上调的去泛素化酶；随后经 GEPIA2、Kaplan-Meier Plotter 等工具分析，证实 USP25 是唯一与 HNSCC 患者总生存期缩短相关的去泛素化酶，低表达 USP25 的患者临床结局更差。同时，TCGA 数据库分析显示 USP25 在包括 HNSCC 在内的多种癌症中均呈下调趋势；组织芯片（TMA）的 mIHC 染色及生存分析进一步验证了这一结论。此外，qRT-PCR 结果表明 HNSCC 组织中 USP25 表达较癌旁正常组织显著降低，且淋巴结转移阳性的肿瘤组织中 USP25 表达更低；qPCR 和 Western blot 实验则证实，与正常人口腔角质形成细胞（HOK）相比，所有 HNSCC 细胞系中 USP25 的 mRNA 和蛋白水平均明显下调，综合表明 USP25 低表达与 HNSCC 恶性进展及不良预后密切相关。

Figure 2：USP25 在体内调控 HNSCC 的恶性进展但不直接影响肿瘤细胞体外生物学功能

该图通过体内动物模型和体外细胞实验，明确了 USP25 对 HNSCC 进展的调控作用及特点。研究者构建 4-NQO 诱导的小鼠 HNSCC 模型，在 16、26、32 周收集舌组织标本，发现随着肿瘤体积增大，淋巴结转移率逐渐升高，HE 染色和 IHC 结果显示，癌组织中 USP25 表达较正常组织显著下调，且发生淋巴结转移的肿瘤组织中 USP25 表达最低；GEO 数据库（GSE30784）分析进一步证实，从正常组织、不典型增生组织到癌组织，USP25 表达逐渐降低，提示其下调是恶性转化的早期且持续事件。体外实验中，在正常 HOK 细胞中敲低 USP25 后，细胞增殖和迁移未受显著影响；在 HNSCC 细胞系（SCC15、SCC25）中通过慢病毒转导稳定过表达 USP25 后，CCK8、克隆形成实验显示细胞增殖无明显差异，伤口愈合和 Transwell 实验也表明细胞迁移和侵袭能力未发生显著改变，说明 USP25 主要在体内调控 HNSCC 的恶性进展，而非直接影响肿瘤细胞的体外生物学功能。

Figure 3：USP25 低表达与 HNSCC 的免疫抑制性肿瘤微环境相关

该图借助单细胞测序和多种验证手段，揭示了 USP25 表达与 HNSCC 肿瘤免疫微环境（TIME）的关联。通过分析 GEO 数据库（GSE181919）的单细胞 RNA 测序数据，经 UMAP 降维和无监督聚类，将髓系细胞分为树突状细胞、巨噬细胞、髓系来源抑制细胞（MDSCs）等 8 个亚群，将 T 细胞分为 CD8+T 细胞及其他亚群，发现 USP25 低表达组的 T 细胞比例显著降低，而 MDSCs 比例升高。MDSCs 的特征标志物 S100A8、S100A9 在 USP25 低表达的肿瘤 MDSC 亚群中富集，提示 USP25 低表达可能通过诱导 MDSCs 积累损害 CD8+T 细胞的抗肿瘤免疫功能。此外，TIMER 数据库分析显示，USP25 表达与 HNSCC 患者肿瘤组织中 CD8+T 细胞浸润呈正相关，与 MDSCs 浸润呈负相关；组织芯片的 mIHC 染色结果进一步验证，USP25 低表达的肿瘤组织中 CD8+T 细胞浸润减少、MDSCs 浸润增加，证实 USP25 在调控 HNSCC 免疫抑制性微环境中发挥关键作用。

Figure 4：USP25 过表达减少 MDSCs 数量并增加细胞毒性 T 细胞浸润

该图通过小鼠同源肿瘤模型验证了 USP25 对肿瘤免疫微环境的调控效应。研究者构建稳定过表达 USP25 的 HNSCC 同源肿瘤模型，发现与对照组相比，USP25 过表达组的肿瘤体积和重量显著减小，而小鼠体重无明显变化，表明 USP25 过表达可抑制体内肿瘤生长且无明显毒性。IHC 染色检测显示，USP25 过表达的肿瘤组织中，CD8+T 细胞浸润增加，而 MDSCs（CD11b + 标记）浸润减少；功能实验进一步证实，从 USP25 过表达组肿瘤中分离的 MDSCs，对 T 细胞增殖和 IFN-γ 分泌的抑制作用显著弱于对照组，说明 USP25 过表达可逆转肿瘤免疫抑制状态，构建免疫激活型抗肿瘤微环境，其机制与减少 MDSCs 浸润、促进细胞毒性 T 细胞浸润相关。

Figure 5：USP25 上调通过抑制 MAPK 通路激活和 IL-6 分泌，减弱 MDSCs 迁移

该图深入探究了 USP25 调控 MDSCs 浸润的分子机制。通过对 USP25 过表达细胞和对照组细胞进行 RNA-seq，筛选出差异表达的可溶性因子，发现 IL-6 是差异最显著的细胞因子；Western blot 和 ELISA 实验证实，USP25 过表达可显著降低 HNSCC 细胞（SCC15、SCC25）中 IL-6 的 mRNA 和蛋白表达及分泌水平，而敲低 USP25 则呈现相反效应。Transwell 趋化实验显示，与 USP25 低表达的肿瘤细胞共培养时，MDSCs 的趋化活性增强，而加入 IL-6 受体抗体可阻断这一效应；反之，与 USP25 过表达的肿瘤细胞共培养时，MDSCs 趋化活性减弱，加入 IL-6 则可逆转该趋势。此外，RNA-seq 的 KEGG 富集分析显示，MAPK 信号通路在 USP25 低表达组显著激活；Western blot 证实，USP25 过表达可抑制 HNSCC 细胞中 MAPK 通路的激活（降低 P-p38、P-ERK 水平）及 IL-6 转录因子 AP-1（c-Jun 亚基）的表达，表明 USP25 通过抑制 MAPK-IL-6 通路，减弱 MDSCs 的迁移能力。

Figure 6：USP25 通过 UIM2 结构域结合 TAB2 并去除其 K63 连接泛素链，抑制 MAPK 信号传导

该图明确了 USP25 调控 MAPK 通路的分子靶点及作用方式。免疫沉淀（Co-IP）和免疫荧光共定位实验证实，USP25 与 TAB2 存在直接相互作用，而不与 TAK1、TAB3 等其他上游信号分子结合。通过构建缺失不同结构域的 USP25 突变体进行 Co-IP 实验，发现 USP25 通过其 UIM2 结构域与 TAB2 发生物理结合。进一步的泛素化实验显示，TAB2 的 K63 连接泛素化对其激活下游 MAPK 信号至关重要，而野生型 USP25 和 C178A 突变体可显著降低 TAB2 的 K63 泛素化水平，H608A 突变体则无此效应，表明 USP25 的去泛素化酶活性依赖于 H608 残基。体外去泛素化实验进一步证实，稳定表达 USP25 的 HNSCC 细胞中，内源性 TAB2 的 K63 泛素化水平显著升高，综合表明 USP25 通过 UIM2 结构域结合 TAB2，去除其 K63 连接泛素链，从而抑制 MAPK 信号通路的激活。

Figure 7：USP25 过表达增强 HNSCC 对 PD-1 抑制剂的体内治疗敏感性

该图验证了 USP25 过表达对 HNSCC 免疫治疗疗效的影响。研究者构建 MOC1 细胞（小鼠口腔鳞癌细胞）的同源肿瘤模型，将 MOC1 NC（对照）和 MOC1 OE-USP25（USP25 过表达）细胞分别植入小鼠体内，待肿瘤体积达到 50-100mm³ 后，给予 PD-1 抑制剂（10mg/kg）或生理盐水治疗。结果显示，USP25 过表达组的肿瘤体积和重量显著小于对照组，且联合 PD-1 抑制剂治疗后，肿瘤抑制效果更显著，而各组小鼠体重无明显差异，表明该联合方案无明显毒性。流式细胞术（FC）分析显示，USP25 过表达联合 PD-1 抑制剂治疗组中，肿瘤组织内 MDSCs 积累减少，而功能性 CD8+T 细胞（包括 Granzyme B+、IFN-γ+、TNF-α+ 亚群）数量显著增加，说明 USP25 过表达可通过改善肿瘤免疫微环境，增强 HNSCC 对 PD-1 抑制剂的治疗敏感性。

Figure 8：USP25 调控 HNSCC 免疫抑制微环境的分子机制示意图

该图以 schematic 形式清晰呈现了 USP25 在 HNSCC 中的作用机制及调控网络。当肿瘤细胞中 USP25 低表达时，TAB2 的 K63 连接泛素化水平升高，进而激活 TAK1 介导的 MAPK 信号通路，促进转录因子 AP-1 活化，上调 IL-6 的基因表达和分泌；IL-6 作为趋化因子，会招募 MDSCs 进入肿瘤微环境，而 MDSCs 会抑制 CD8+T 细胞的功能，形成免疫抑制性微环境，最终促进肿瘤进展并降低对免疫治疗的应答。当 USP25 高表达时，其通过 UIM2 结构域结合 TAB2，去除其 K63 连接泛素链，抑制 MAPK 通路激活和 IL-6 分泌，减少 MDSCs 迁移和积累，同时促进 CD8+T 细胞浸润并增强其抗肿瘤功能，逆转免疫抑制微环境，从而抑制肿瘤进展并提高对 PD-1 抑制剂的治疗敏感性。

本研究明确 USP25 在 HNSCC 中扮演肿瘤免疫微环境调控因子的角色，其低表达与患者不良预后及免疫抑制性微环境密切相关。机制上，USP25 通过结合 TAB2 并去除其 K63 连接泛素链，抑制 MAPK-IL-6 通路，减少 MDSCs 浸润并促进 CD8+T 细胞功能，从而逆转免疫抑制状态。此外，USP25 过表达可显著增强 HNSCC 对 PD-1 抑制剂的治疗应答。综上，USP25 不仅是 HNSCC 预后评估的潜在生物标志物，更可作为免疫治疗联合靶点，为改善晚期 HNSCC 患者免疫治疗效果提供新策略。

局限性：未深入探究 USP25 在不同亚型 HNSCC 中的作用差异，缺乏临床样本中 USP25 与免疫治疗疗效的直接关联数据。展望：未来可扩大临床样本量，验证 USP25 对免疫治疗应答的预测价值；探索 USP25 激动剂与 PD-1 抑制剂的联合治疗方案，为 HNSCC 精准免疫治疗提供新方向。