郑州大学第一附属医院丨HAX-1 通过竞争性结合 NLRP3 抑制小胶质细胞焦亡,为脑缺血再灌注损伤提供新靶点

急性脑梗死具有高致残率和致死率，血管再通治疗后的脑缺血再灌注（I/R）损伤严重限制神经功能恢复，小胶质细胞焦亡与脑 I/R 损伤后的炎症反应密切相关，NLRP3 炎症小体组装是小胶质细胞焦亡的关键环节，HAX-1 作为抗凋亡蛋白在神经系统中发挥重要作用，但其在脑 I/R 损伤中对小胶质细胞焦亡的调控作用及机制尚未阐明。

先在体内 tMCAO 模型和体外 OGD/R 模型中验证脑 I/R 损伤后小胶质细胞焦亡激活与 HAX-1 表达的关联，再通过调控 HAX-1 的体内外表达，明确其对脑梗死面积、小胶质细胞焦亡、炎症因子释放及神经元凋亡的影响，接着利用 NLRP3 抑制剂验证 NLRP3 在 HAX-1 调控焦亡中的介导作用，随后通过 Co-IP、免疫荧光共定位探究 HAX-1 与 NLRP3/ASC 的相互作用，最后借助 BLI 技术和分子对接揭示 HAX-1 调控 NLRP3 炎症小体形成的分子机制，明确 HAX-1 的神经保护作用靶点。

脑 I/R 损伤后小鼠梗死区和小胶质细胞 OGD/R 模型中 HAX-1 表达显著下调，小胶质细胞焦亡通路激活，NLRP3-ASC 组装增强，神经元凋亡增加；过表达 HAX-1 可显著减小脑梗死面积，抑制 Caspase1、GSDMD 的活化和 IL-1/IL-18 释放，减少小胶质细胞焦亡和神经元凋亡，敲低 HAX-1 则作用相反；NLRP3 抑制剂 MCC950 可阻断 HAX-1 敲低引发的焦亡通路激活；Co-IP 和免疫荧光证实 HAX-1 可与 NLRP3 结合，且抑制 NLRP3 与 ASC 的相互作用；BLI 和分子对接显示 HAX-1 与 ASC 对 NLRP3 存在竞争性结合，二者结合位点相似、结合亲和力相近，HAX-1 通过此方式阻断 NLRP3 炎症小体组装。

Fig1：证实小鼠 tMCAO 模型中脑梗死区小胶质细胞发生焦亡，且焦亡促进梗死区神经元凋亡；梗死区焦亡相关蛋白活化，NLRP3 与 ASC 在小胶质细胞中共定位增强，Caspase1 抑制剂可显著减少梗死区神经元凋亡。

Fig2：证实小鼠 tMCAO 模型中梗死区 HAX-1 表达降低，HAX-1 可调控梗死区焦亡通路激活，过表达 HAX-1 能抑制焦亡、减少神经元凋亡，敲低 HAX-1 则加剧焦亡和神经元凋亡，扩大脑梗死面积。

Fig3：证实体外 OGD/R 模型中小胶质细胞 HAX-1 表达下调，HAX-1 可抑制小胶质细胞焦亡通路激活和 NLRP3-ASC 的聚集，过表达 HAX-1 减少炎症因子释放，敲低则促进焦亡和炎症因子释放。

Fig4：证实 NLRP3 是 HAX-1 调控小胶质细胞焦亡的关键靶点，HAX-1 通过抑制 NLRP3 与 ASC 的相互作用，阻断小胶质细胞中 NLRP3 炎症小体的形成。

Fig5：证实在小鼠 tMCAO 模型中，HAX-1 可在体内抑制 NLRP3 与 ASC 的结合，减少 NLRP3-ASC-Caspase1 的共定位和炎症小体形成，验证了 HAX-1 在体内对 NLRP3 炎症小体的调控作用。

Fig6：通过 BLI 技术证实 HAX-1 与 ASC 均可结合 NLRP3 且无相互结合，二者存在浓度依赖性的竞争性结合；分子对接显示二者在 NLRP3 上的结合位点相似、结合自由能相近，明确 HAX-1 竞争性结合 NLRP3 的分子基础。

Fig7：以示意图形式直观展示 HAX-1 抑制小胶质细胞焦亡的机制：脑 I/R 损伤导致 HAX-1 降解，HAX-1 缺失后 NLRP3 与 ASC 结合组装成炎症小体，激活 Caspase1 和 GSDMD，引发细胞膜穿孔和炎症介质释放，最终导致小胶质细胞焦亡，而 HAX-1 可竞争性结合 NLRP3，阻断上述过程实现神经保护。

研究证实脑 I/R 损伤后小胶质细胞焦亡是神经元凋亡的重要诱因，HAX-1 作为神经保护蛋白在梗死区表达下调，其通过调控 NLRP3 炎症小体形成抑制小胶质细胞焦亡，减少炎症介质释放，从而减轻神经元凋亡和脑梗死损伤；体内外实验均验证 HAX-1 的抗焦亡作用依赖 NLRP3，且通过与 ASC 竞争性结合 NLRP3 阻断 NLRP3-ASC 组装，分子层面明确了二者的竞争性结合特征；该研究首次揭示 HAX-1 在脑 I/R 损伤中调控小胶质细胞焦亡的新机制，为脑梗死治疗提供了新的潜在靶点。但研究仍存在局限性，目前尚未阐明 HAX-1 在脑 I/R 损伤中表达下调的具体调控机制，且 HAX-1 对神经元凋亡是否存在直接调控作用及相关机制也未明确，上述问题将成为后续研究的重点方向。