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文献信息

【题目】PHGDH phosphorylation mediated by WNK1 serves as a dual marker of metabolic vulnerability and responsiveness to oxaliplatin treatment

【期刊】Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America

【影响因子】9.1

【doi】10.1073/pnas.2525213123

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图1. 丝氨酸水平升高与 PHGDH 表达是癌症生长的必要条件。(A)人类胃癌组织及其配对邻近组织样本（n=27）的非靶向 UPLC -MS代谢组学分析流程图。(B)代谢组学数据的主成分分析。(C)人类胃癌组织相对于配对邻近正常组织的差异代谢物火山图（n=27样本，队列1）。(D)代谢物类别变化对通路的影响。(E)胃癌组织及其配对邻近正常组织中检测到的丝氨酸水平。(F) TCGA 数据库中胃癌患者（n=154）的单变量Cox回归分析显示与生存相关的通路。(G)人类胃黏膜上皮细胞（GES-1）及胃癌细胞（AGS、HGC27、MGC803、NCI-N87和SNU-1）中的丝氨酸水平。(H)细胞内U-[13C]-葡萄糖掺入丝氨酸的示意图。m/z，质荷比。(I)人类胃黏膜上皮细胞（GES-1）与胃癌细胞（MGC803）中丝氨酸13C掺入效应（n=4个生物学独立细胞样本）。(J) PHGDH 敲低（shPHGDH）与对照组（shC）相比对MGC803细胞中丝氨酸13C掺入（M+3）的影响（n=4个生物学独立细胞样本）。(K) PHGDH 敲低（shPHGDH）与对照组（shC）相比MGC803细胞中20种差异代谢物的热图（n=4个独立生物学细胞样本）。（L–N）肿瘤图像(L)、肿瘤重量(M)并基于 IHC 染色(N)呈现了 PHGDH 蛋白表达情况。

图2. WNK1通过磷酸化 PHGDH 蛋白的Ser349和Ser371位点来增强其酶活性。(A)采用泛磷酸化抗体进行蛋白质印迹分析，比较活性WNK1与失活 PHGDH 在体外激酶活性实验中的差异。(B)HEK293T细胞中共表达 GFP -WNK1与Flag- PHGDH 蛋白；Flag- PHGDH 经免疫沉淀后通过蛋白质印迹法（WB）分析磷酸化状态。（C和D）通过免疫沉淀（IP）和蛋白质印迹法分析WNK1敲低后HGC27和MGC803细胞中 PHGDH 磷酸化水平。(E)通过蛋白质印迹法分析WNK1诱导的 PHGDH 磷酸化呈剂量依赖性增加及NCT-503抑制作用。(F)采用具有激酶活性与失活突变体的WNK1进行体外激酶活性实验，并通过蛋白质印迹法验证。(G)运用NetPhos 3.0算法预测 PHGDH WNK1结合ASB结构域（残基323-455）中的磷酸化位点。(H)通过蛋白质印迹法分析WNK1与 PHGDH 突变体（S326A、S349A、S362A、S371A）的体外激酶活性实验。(I)不同物种间 PHGDH S349与S371氨基酸残基的序列比对。(J)使用磷酸化特异性抗体检测 PHGDH 野生型、单点突变体（S349A、S371A）及双突变体（S2A）与活性WNK1共孵育后的蛋白质印迹结果。(K)以3-PG为底物评估 PHGDH 野生型及突变体（S349A、S371A、S2A、S2D）的酶动力学特性。(L)在HEK293T细胞中进行[32P]-ATP标记实验，检测 PHGDH 野生型与S2A突变体与WNK1野生型或S382A突变体共表达时的ADP水平变化。（M和N）在WNK1过表达或敲低条件下，转染 PHGDH 野生型、S349A、S371A、S2A或S2D的HEK293T(M)与MGC803(N)细胞中进行 PHGDH 酶活性测定。

图3. PHGDH 表达与丝氨酸代谢与胃癌奥沙利铂耐药性相关性分析。(A–D) 通过酶活性测定或代谢物定量法检测奥沙利铂应答组（n=8）与无应答组（n=6）肿瘤组织中 PHGDH 酶活性相对水平(A)、细胞内丝氨酸(B)、 GSH (C)及脂质活性氧(D)的变化。(E) 基于GSE128967数据集（应答组n=4；无应答组n=7）进行应答组与无应答组差异基因表达的 KEGG 通路富集分析。(F) 以 PHGDH 为核心的蛋白质相互作用网络图（采用STRING数据库构建），显示甘氨酸、丝氨酸及苏氨酸代谢相关酶群。(G) 接受奥沙利铂新辅助化疗临床队列示意图（n=60例样本，队列2）。病理评估将患者分为应答组（TRG 0-1，n=23）与无应答组（TRG 2-3，n=37）。(H) 不同 TRG 评分患者肿瘤样本的H&E染色与 PHGDH IHC 染色代表性结果，及应答组与无应答组 PHGDH 表达分布对比。(I-J) MGC803(I)与NCI-N87(J)细胞经奥沙利铂处理72小时后的剂量-效应曲线，分别显示 PHGDH 抑制剂（NCT-503）与 PHGDH 过表达条件下的实验结果。细胞活力通过 MTT 法进行评估。(K) 显示经奥沙利铂、NCT-503或其联合治疗后HGC27和MGC803细胞DNA损伤加剧的彗星实验结果。(L) 经奥沙利铂、NCT-503或其联合处理细胞中 γ -H2AX（绿色）与 DAPI（蓝色）的免疫荧光染色结果。(M) 各治疗组切除 PDX 肿瘤的代表性图像。(N) 各组肿瘤体积定量分析（每组n=6只小鼠）。(O) 不同处理条件下类器官培养的代表性图像。各组别分别展示对照组、奥沙利铂组（Oxa）、NCT-503组及奥沙利铂+NCT-503联合组的类器官形态学特征。(P) 类器官培养物中集落数量的定量分析。

图4. Ser349/Ser371位点 PHGDH 磷酸化调控DNA损伤反应及奥沙利铂敏感性，可作为胃癌潜在预测生物标志物。(A) 指定条件下HGC27与MGC803细胞中 γ -H2AX水平的蛋白质印迹分析。（上）shWNK1细胞经奥沙利铂处理。（下）用rPHGDH-WT或磷酸化缺陷突变体rPHGDH-S2A重建的 PHGDH 敲除细胞。(B和C) 表达rPHGDH-WT或rPHGDH-S2A的HGC27与MGC803(B)细胞经奥沙利铂处理72小时后的剂量-反应曲线。细胞活力通过 MTT 法测定。(D) 显示过氧化氢或奥沙利铂(Oxa)处理后，用rPHGDH-WT或rPHGDH-S2A重建的HGC27与MGC803细胞中DNA损伤的彗星实验。(E) (D)组处理细胞中 γ -H2AX焦点（绿色）的免疫荧光检测；细胞核用 DAPI（蓝色）复染。(F) 热图显示按肿瘤消退分级（TRG 组）分层患者的临床、病理及蛋白表达特征。 PHGDH 、WNK1及pPHGDH(S349/S371)表达水平采用颜色编码。(G) 低 PHGDH 磷酸化水平与高 PHGDH 磷酸化水平患者pPHGDH(S349/S371)的代表性H&E染色、 IHC 染色及治疗前后CT图像对比。(H) ROC曲线显示训练集(n=60)中 PHGDH 、WNK1及pPHGDH(S349/S371)对奥沙利铂反应的预测价值。(I) ROC曲线显示外部验证集(n=32)中pPHGDH(S349/S371)对奥沙利铂反应的预测价值。

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