肝癌免疫治疗新突破!郑州大学/南京医科大学团队 2026 z年 14.1 分发刊,新型 CAR-NKT 细胞外囊泡,攻克肝癌的新一代免疫治疗利器

• 以人源 TM4SF1 蛋白为抗原，通过羊驼纳米抗体噬菌体展示文库进行三轮淘选，获得 9 种候选纳米抗体。
• 经 ELISA 和表面等离子体共振（SPR）验证，筛选出对人源和鼠源 TM4SF1 均具有高亲和力的 A18 纳米抗体（人源 KD=22.1nM，鼠源 KD=46.4nM）。

• 从 C57BL/6J 小鼠脾脏分离 NKT 细胞，通过逆转录病毒将 A18 纳米抗体整合到 CAR 结构中，构建 CAR⁴SF¹-NKT 细胞。
• 体外扩增 CAR⁴SF¹-NKT 细胞，收集培养上清液，通过超速离心法分离纯化得到 CAR⁴SF¹-EVs，并鉴定其形态、标志物及表面 CAR 蛋白表达。

• 利用 ELISA、免疫荧光和活体成像技术，验证 CAR⁴SF¹-EVs 对 TM4SF1 高表达肿瘤细胞的特异性结合能力及体内肿瘤靶向性。
• 通过高低剂量对比实验，评估 CAR⁴SF¹-EVs 与 CAR-NKT 细胞在小鼠模型中的毒性差异，明确其安全性优势。

• 从诱导免疫原性细胞死亡（ICD）、重塑肿瘤免疫微环境、激活 CD8⁺T 细胞等角度，解析 CAR⁴SF¹-EVs 的抗肿瘤机制。
• 开展 CAR⁴SF¹-EVs 与 PD-1/CTLA-4 抑制剂的联合治疗实验，验证协同增效作用及长效免疫记忆的形成。

• 靶向性：CAR⁴SF¹-EVs 可特异性结合 TM4SF1 高表达的 H22、Hepa1-6 肝癌细胞，而不结合 TM4SF1 敲除的肿瘤细胞；活体成像显示，CAR⁴SF¹-EVs 在注射后 12h 在肿瘤部位达到富集峰值，且在正常组织中分布极少。

• 安全性：高剂量 CAR-NKT 细胞注射导致小鼠 14 天内 100% 死亡，而高低剂量 CAR⁴SF¹-EVs 组均无小鼠死亡或明显不良反应，血常规和组织病理检测显示各器官无异常。

CAR⁴SF¹-EVs 通过内质网应激诱导肿瘤细胞发生 ICD

• CAR⁴SF¹-EVs 处理后，肿瘤细胞表面钙网蛋白（CRT）、ERp57 表达上调，同时释放 ATP、HMGB1 等损伤相关分子模式（DAMPs），符合 ICD 的典型特征。

• 机制研究表明，CAR⁴SF¹-EVs 携带的 FasL 是关键效应分子，通过激活内质网应激通路，诱导肿瘤细胞凋亡；抑制内质网应激可显著削弱其抗肿瘤效果。

CAR⁴SF¹-EVs 重塑肿瘤免疫微环境，依赖 CD8⁺T 细胞发挥作用

• RNA 测序结果显示，CAR⁴SF¹-EVs 处理后，肿瘤组织中细胞因子信号通路、NF-κB 通路显著激活，促炎细胞因子（TNF-α、IFN-γ）和趋化因子表达上调。

• 流式细胞术检测发现，肿瘤微环境中成熟树突状细胞、M1 型巨噬细胞、CD4⁺T 细胞和 CD8⁺T 细胞浸润显著增加；耗竭 CD8⁺T 细胞后，CAR⁴SF¹-EVs 的抗肿瘤效果明显减弱，证实 CD8⁺T 细胞是其发挥作用的核心。

CAR⁴SF¹-EVs 与免疫检查点抑制剂协同增效，诱导长效免疫记忆

• 单独使用 PD-1 或 CTLA-4 抑制剂对肝癌模型的治疗效果有限，而与 CAR⁴SF¹-EVs 联合使用后，肿瘤体积显著缩小，小鼠生存期大幅延长。

• 联合治疗组小鼠在肿瘤完全消退后，再次接种肿瘤细胞时无肿瘤生长，且脾脏中 CD4⁺和 CD8⁺效应记忆 T 细胞比例显著升高，表明成功诱导了长效抗肿瘤免疫记忆。