细胞膜作为连接细胞与周围环境的动态界面，承载着反映细胞身份、状态和异常的生物标志物。细胞损伤导致核酸等内容物释放，异常膜蛋白表达是癌症和神经退行性疾病的标志，免疫细胞与肿瘤细胞膜界面结合事件对疾病进展具有重要意义。因此，开发能够灵敏、准确、空间分辨地解析这些事件相关生物标志物的技术至关重要。
DNA编码的逻辑门系统因其可编程性、生物相容性和多功能分子设计，已成为细胞事件成像的强大工具。然而，现有技术面临两大瓶颈：
开发一种创新平台，实现：
集成化DNA逻辑门元件（iLGE）：通过多价串联架构提升多靶点识别与计算能力
细胞膜限域DNA步行器装置（DWD）：实现空间限域的信号扩增，提高灵敏度和精度
多模态细胞事件成像：应用于细胞损伤、肿瘤发生和NK细胞-肿瘤细胞相互作用的高灵敏、精确检测
集成DNA逻辑门元件（iLGE）设计
架构创新：将传统单价DNA逻辑单元编码为多价串联结构，通过分支DNA纳米线构建下一代集成逻辑门元件
性能提升：实现并行布尔运算，计算效率提升3倍，降低空间依赖性
多价识别：通过调整单体比例编码不同数量功能序列，提高细胞结合亲和力（Kd从8.287 nM降至6.695 nM）
环境稳定性：高血清浓度和温度条件下保持识别稳定性，优于低价态iLGE
细胞膜锚定DNA步行器装置（DWD）
结构设计：基于多价胆固醇标记DNA三棱柱框架，整合DNAzyme信号开关和底物
膜锚定机制：胆固醇介导的膜插入实现稳定锚定，抵抗阳离子蛋白吸附和血清降解
双空间限域策略：DNA框架结构限域+细胞膜界面限域，显著提升信号扩增效率
Ca²⁺依赖性DNAzyme优化：筛选出Ca²⁺-DNAzyme 4，在200 μM Ca²⁺（低于血液浓度1.0 mM）下实现最佳催化活性
多靶点识别与信号放大机制
AND门控激活：传统逻辑元件序列作为AND门开关，仅当两个逻辑元件序列同时存在时解除DNAzyme阻断
膜流动性增强信号：细胞膜的流动性显著增强DWD信号扩增能力，固定化细胞荧光强度显著降低
空间限域优势：膜限域DNAzyme相比游离DNAzyme具有更快反应速率和更大信号放大强度
多模态细胞事件成像应用
细胞损伤监测：基于miRNA122激活的DWD系统，通过电刺激和乙醇诱导的肝细胞损伤模型，高灵敏检测胞外释放的miRNA
肿瘤细胞精确识别：Sgc8/TC01-iLGE耦合rDWD，通过识别PTK7和TC01蛋白实现AND逻辑门控，特异性识别CEM白血病细胞，在混合细胞体系中准确率达90%
NK-肿瘤细胞相互作用成像：设计"抗体"和"拉链"两种细胞结合策略，实现NK细胞与肿瘤细胞物理相互作用的精确、灵敏成像，并诱导NK细胞介导的肿瘤杀伤（杀伤率46-55.2%）
技术平台创新：建立了首个集成DNA逻辑门驱动的细胞膜限域扩增系统，将分子计算与空间纳米工程相结合，突破了传统DNA逻辑门在多靶点识别和信号扩增方面的瓶颈
多维度性能提升：
计算效率提升3倍
空间依赖性显著降低
信号扩增效率和环境稳健性大幅提高
为活细胞膜界面生物标志物检测提供了通用工具包
临床转化潜力：
方法学价值：该工作为合成DNA纳米技术与临床可行动诊断学之间架起了桥梁，在疾病分层、治疗评估和免疫治疗优化等精准医学应用中具有变革性潜力
图6. FACP2/OVA/cGAMP纳米疫苗的免疫激活与抗肿瘤效应
(A) 通过递送cGAMP激活树突状细胞(DCs)内STING通路的示意图。
(B) 蛋白质印迹法分析显示cGAS-STING-TBK1-IRF3信号通路的激活。
(C) 骨髓源性树突状细胞(BMDCs)经FACP2/OVA/cGAMP纳米颗粒处理后，其上清液中IFN-β的浓度。
(D, E) 经FACP2/OVA/cGAMP纳米颗粒孵育24小时后，诱导BMDC成熟 (D) 及交叉呈递 (E) 的定量分析。
(F) FACP2/OVA/cGAMP在B16-OVA荷瘤小鼠中治疗方案的实验示意图。
(G-J) 经不同制剂治疗的B16-OVA荷瘤小鼠的肿瘤生长（G和J）、生存曲线（H）及体重（I）变化。
(K) 流式细胞术分析肿瘤引流淋巴结(tLNs)中CD3+CD8+ T细胞。
肿瘤内 (L) T细胞（CD3+）、(M) 活化T细胞（CD3+CD8+）及 (N) 细胞毒性T细胞（CD3+CD8+IFNγ+）的相对水平。
图2. 溶液中的集成逻辑门驱动DNA行走者扩增系统
(a) DWD和DNA纳米线结构的琼脂糖凝胶电泳表征。从左至右：DNA标记、DWD、iLGE。
(b) iLGE的原子力显微镜成像结果。
(c) iLGE的长度分析，其统计评估如 (d) 所示（n=20）。
(e) DWD结构的原子力显微镜(AFM)成像。
(f) 使用AFM对图(e)中DWD结构的高度分析，其统计分析如 (g) 所示（n=20）。
(h) 底物的Ca²⁺依赖性DNAzyme切割的PAGE分析。泳道1-2：DNAzyme和底物(Sub)；泳道3-9：分别在0 mM、0.1 mM、0.2 mM、0.5 mM、1.0 mM、2.0 mM和3.0 mM Ca²⁺浓度下的切割结果。
(i) 对图(h)中底物条带强度的定量分析。
(j) DNAzyme对底物链切割活性的PAGE分析。泳道1-2：DNAzyme和Sub；泳道3-9：DNAzyme与底物的浓度比分别为1:1（无Ca²⁺）、1:1、1:2、1:5、1:10、1:20和1:20，其中泳道4-8在室温下反应，泳道9在37°C下反应。
(k) 底物的时间依赖性DNAzyme切割的PAGE分析。泳道1-2：DNAzyme和Sub；泳道3-11：0分钟、10分钟、20分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、240分钟和360分钟时的切割结果。
(l) 对图(k)中底物条带强度的定量分析。
(m) 逻辑门激活的DNAzyme切割活性的PAGE分析。泳道1-7：Sub、DNAzyme-block + Sub、DNAzyme-block + Sub + LGE-E1、DNAzyme-block + Sub + LGE-E2、DNAzyme-block + Sub + LGE-E1 + LGE-E2。
(n) iLGE驱动的DWD荧光扩增系统的荧光光谱分析。曲线i-vii对应：i) Sub， ii) DNAzyme-block + Sub， iii) DNAzyme-block + Sub + LGE-E1， iv) DNAzyme-block + Sub + LGE-E2， v) DNAzyme-block + Sub + tLGE-E1/E2， vi) DWD + iLGE-E1/E2， vii) DWD + tLGE-E1/E2。
iLGE的细胞识别与逻辑计算性能评估
(a) 不同价态Sgc8-iLGE与CEM细胞结合的流式细胞术分析。
(b) 结合了两种价态Sgc8-iLGE的CEM细胞的共聚焦成像。比例尺：20 μm。
(c) 低价态与多价Sgc8-iLGE与CEM细胞结合亲和力的分析。
(d) 在4°C和37°C下，于0%和10% FBS培养基中，低价态与多价Sgc8-iLGE与CEM细胞结合稳定性的流式细胞术分析。
(e-h) 评估tLGE和iLGE识别CEM细胞的计算能力。(e) 流式细胞术分析与统计...
图4. DWD在细胞表面锚定性能评估
(a) DWD锚定于细胞膜的共聚焦成像。从左至右样品分别为：仅CEM细胞、CEM + 无胆固醇DWD、CEM + DWD + DNA外切酶 I/III、CEM + DWD + 链A。比例尺：30 μm。
(b) DWD在细胞膜上锚定的流式细胞术分析。
(c) 在室温下，于2%或10% FBS培养基中，DWD在CEM细胞膜上锚定随时间变化的稳定性，通过共聚焦成像观察。比例尺：30 μm。
(d) 根据(c)中共聚焦数据对细胞膜荧光强度进行的定量统计分析。
(e) 在10% FBS培养基中，于25°C和37°C下，DWD在CEM细胞膜上锚定随时间变化的稳定性的流式细胞术表征。
(f) DWD在Ramos细胞和HepG2细胞表面锚定的共聚焦成像。比例尺分别为：50 μm 和 30 μm。
(g) 经不同浓度DWD处理的CEM细胞的CCK-8检测结果（n=3）。
图S. DWD在细胞膜界面信号放大性能评估
(a) DWD在细胞膜界面对靶标响应的信号放大共聚焦成像。比例尺：30 μm。
(b) 流式细胞术分析（左图）显示细胞膜流动性对DWD信号放大的影响。使用多聚甲醛固定细胞降低了膜流动性，活细胞与固定细胞膜间的DWD荧光信号存在显著差异（右图，P=0.0005）。
(c) 共聚焦成像（左图）比较DWD限制的DNAzyme与游离DNAzyme在细胞膜界面切割底物的荧光信号放大能力，样本间膜荧光强度存在显著差异（右图，P<0.0001）。比例尺：30 μm。
(d) 流式细胞术分析DWD限制的DNAzyme与游离DNAzyme在细胞膜界面切割底物的荧光信号放大能力。
(e) 游离与受限制DNAzyme在细胞膜界面驱动的时间依赖性荧光信号变化分析。
(f-g) DWD检测受损细胞、识别细胞外释放miRNA122的流式细胞术分析。检测由电刺激（f，左图）和乙醇（g，左图）诱导的细胞损伤。使用DWD检测到损伤前后存在显著荧光差异（f-g 右图，P<0.0001）。
图6. iLGE驱动的膜界面放大系统实现精准灵敏的细胞识别
(a) 膜界面DWD信号放大系统的逻辑门特异性激活的流式细胞术分析。从下至上依次为：DWD、DWD + TCO1-iLGE、DWD + Sgc8-iLGE、DWD + TCO1/Sgc8-iLGE。
(b) iLGE驱动的膜界面放大系统的共聚焦成像：DWD、dSub-DWD + TCO1/Sgc8-iLGE、以及 rDWD + TCO1/Sgc8-iLGE。比例尺：50 μm。
(c) 基于(b)中数据对细胞膜荧光定量结果进行显著差异的统计分析（P<0.0001）。
(d) iLGE驱动的膜界面DWD信号放大系统实现精准灵敏细胞识别的流式细胞术分析：i) rDWD + TCO1/Sgc8-iLGE，ii) dDWD + TCO1/Sgc8-iLGE，iii) dSub-DWD + TCO1/Sgc8-iLGE。
(e-f) iLGE驱动的膜界面DWD信号放大系统在多细胞体系中对靶细胞进行精准灵敏识别。
(e) 多细胞体系中靶细胞识别的共聚焦成像。比例尺：40 μm。
(f) 多细胞体系中靶细胞识别的流式细胞术分析。靶细胞用钙黄绿素绿（Calcein Green）标记。
图7. iLGE偶联DWD用于NK细胞与肿瘤细胞相互作用的精准灵敏成像与杀伤
(a) iLGE偶联DWD诱导NK细胞与CEM细胞聚集的流式细胞术分析。NK细胞用Hoechst染成蓝色，CEM细胞用钙黄绿素（Calcein）标记为绿色，NK-CEM聚集体显示为橙色。
(b) iLGE偶联DWD诱导NK细胞与CEM细胞聚集的共聚焦成像。绿色细胞代表钙黄绿素标记的CEM细胞，蓝色细胞代表Hoechst染色的NK细胞。比例尺：50 μm。
(c-e) iLGE偶联DWD介导的NK-CEM细胞相互作用的精准灵敏检测的共聚焦成像与流式细胞术分析。比例尺：50 μm。
(f-h) iLGE偶联DWD介导的NK细胞特异性杀伤CEM细胞的流式细胞术分析(f) 和共聚焦成像(g)，以及(g) 中所示数据的统计分析(h)。细胞经钙黄绿素/PI染色。比例尺：50 μm。
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